生化大实验.pptx
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1、生化大实验生化大实验实验课程简介实验课程简介 生生化化大大实实验验是是一一门门综综合合性性的的实实验验课课程程,教教学学的的目目的的在在于于通通过过对对生生命命物物质质的的分分离离制制备备,纯纯化化,分分析析等等综综合合性性实实验验,在在已已掌掌握握的的基基础础生生物物化化学学理理论论知知识识和和生生化化实实验验常常用用方方法法的的基基本本原原理理、基基本本操操作作技技术术(如如滴滴定定、比比色色、层层析析、电电泳泳等等)的的基基础础上上,训训练练学学生生的的综综合合实实践践动动手手能能力力,掌掌握握蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等等重重要要物物质质的的分分离离、纯纯化化等等的的测测定定技技术。
2、术。目目录录实验一实验一 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定实验二实验二 离子交换法血清纯化离子交换法血清纯化IgG实验三实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白离子交换层析法分离血清白蛋白实验四实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量实验五实验五 等电聚焦法测定样品的等电点等电聚焦法测定样品的等电点实验六实验六 质粒的分离与纯化质粒的分离与纯化实验七实验七 PCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段实验八实验八 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验实验一实验一蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定(一)考马斯亮蓝法(一)考马斯亮蓝法【实验目的实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓
3、度的原理和方学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。法。【实验原理实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染染料结合法的原理,定量测定微量蛋白质浓度快速、料结合法的原理,定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。灵敏的方法。考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250存存在在着着两两种种不不同同样样色色形形式式,红红色色-棕棕黑黑色色和和蓝蓝色色。染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合后后有有红红色色-棕棕黑黑色色和和蓝蓝色色形形式式,最最大大光光吸吸收收由由465nm变变成成595nm,测测定定595nm吸吸光光的的增增加加量量,可可以以测测定定与与其其结结合合的的
4、蛋蛋白白质质的的量量。蛋蛋白白质质与与染染料料结结合合速速度度很很快快,2min就就可可以以反反应应完完全全,并并可可以以稳稳定定1h,蛋蛋白白质质-染染料料复复合合物物有有很很大大的的消消光光系系数数,使使得得测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度是是灵灵敏敏度度很很高高。测测定定范范围围为为10-100g蛋蛋白白质质,微微量量测测定定时时达达到到1-10g蛋蛋白白质质。此此反反应应反复性好精度高,线性关系好。反复性好精度高,线性关系好。【实验仪器及用品实验仪器及用品】1.标标准准蛋蛋白白液液(0.1mg/ml)0.2g结结晶晶牛牛血清白蛋白用血清白蛋白用0.9%NaCl稀释到稀释到2000ml。2.
5、0.9%NaCl3.考考马马斯斯亮亮蓝蓝试试剂剂:100mg考考马马斯斯亮亮蓝蓝G250溶溶于于50ml5%乙乙醇醇中中,加加100ml85%磷磷酸,蒸馏水稀释酸,蒸馏水稀释1000ml,滤纸过滤。,滤纸过滤。4.待待测测蛋蛋白白:人人血血清清,用用前前用用0.9%NaCl稀释稀释200倍。倍。5.漩涡混合器漩涡混合器6.移液管移液管0.5ml(2),),1.0ml(2),),5ml(1)7.分光光度计分光光度计8.试管试管1.5cm15cm(8)9.量筒量筒100ml(1)10.电子分析天平电子分析天平11.试管架试管架(1)【实验内容及步骤实验内容及步骤】一、标准曲线线的绘制一、标准曲线线
6、的绘制取取7支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。以以A595为纵坐标,标准蛋白质年浓度为横坐标,绘制为纵坐标,标准蛋白质年浓度为横坐标,绘制标准曲线。标准曲线。试剂号试剂号试剂试剂1234561mg/ml标准蛋白液标准蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.15mol/LNaCl/ml10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝染液考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.0摇匀,摇匀,1小时内以小时内以1号管为空白对照,在号管为空白对照,在595nm处比色处比色A5952.未知样液的测定未知样液的测定另取一干净试管,加入样品另取一干净
7、试管,加入样品1.0ml及考马斯亮蓝及考马斯亮蓝染液染液4.0ml,混匀,室温静置,混匀,室温静置3min,于波长,于波长595nm处处比色,读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。比色,读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项注意事项】1、如果测定的要求很严格,可以在试剂加入、如果测定的要求很严格,可以在试剂加入5-20min内测定吸光度,在这段时间内样色很稳定。内测定吸光度,在这段时间内样色很稳定。2、测定中,蛋白质、测定中,蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿染料复合物会吸附在比色皿上,实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。上,实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思
8、考题思考题】1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。(1)样品不容易溶解,但要求结果很准确。(2)要求在半天内测定60个样品。(3)要求很迅速的测定一系列试管(30只)中溶液的蛋白质浓度。2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。二、紫外分光光度法测定蛋白质含量二、紫外分光光度法测定蛋白质含量【实验目的实验目的】1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法。技术和使用方法。【实验原理实验原理】蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭蛋白质中酪氨酸
9、和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在双键,所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,因此可作蛋吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,因此可作蛋白质定量分析。白质定量分析。利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速,简便,不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定,因速,简便,不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定,因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是:此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是:对酪氨酸和苯
10、丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰,此时必须同时测定扰,此时必须同时测定260和和280nm吸光度,通过公吸光度,通过公式校正测定,以消除核酸的影响,而推算处蛋白质浓式校正测定,以消除核酸的影响,而推算处蛋白质浓度。度。不同蛋白质和核酸吸收是不同的,即使校正也存不同蛋白质和核酸吸收是不同的,即使校正也存在误差,但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的在误差,但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为浓度范围为0.11.0mg/mL。【仪器与试剂仪器与试剂
11、】1.紫外分光光度计,比色管(紫外分光光度计,比色管(10ml的的5个),个),吸量管。吸量管。2.标准蛋白质溶液:标准蛋白质溶液:0.9%NaCl溶液溶解溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白,稀释到结晶牛血清白蛋白,稀释到250ml。3.待测蛋白溶液:用酪蛋白配制,浓度在待测蛋白溶液:用酪蛋白配制,浓度在1.0-2.5mg/ml4.0.9%NaCl溶液溶液5.试管试管1.5cm15cm(9)6.移液管移液管1ml(3),),2ml(2),),5ml(2)。)。【实验步骤实验步骤】1、标准曲线法、标准曲线法(1)标准曲线的制作:取)标准曲线的制作:取8只试管按表只试管按表2-5加入试剂,摇加入试
12、剂,摇匀。选择光程匀。选择光程1cm石英比色皿,在石英比色皿,在280nm波长测定波长测定A280,以以A280值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。项 目12345678标准蛋白液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/ml00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280表表1-2紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度-标准曲线的绘制标准曲线的绘制(2)样品测定:)样品测定:配制待测蛋白质溶液配制待测蛋白质溶液1ml,加入
13、蒸馏水,加入蒸馏水3ml,摇,摇匀,测定匀,测定A280,从标准曲线中查出蛋白质浓度。,从标准曲线中查出蛋白质浓度。2.直接测定法直接测定法在紫外分光光度计上,将待测蛋白质溶液加入在紫外分光光度计上,将待测蛋白质溶液加入比色皿,以生理盐水为对照,测定比色皿,以生理盐水为对照,测定280nm和和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度:波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度:蛋白质浓度(蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260(C为蛋白质浓度,为蛋白质浓度,mg/ml,A280和和A260分别为分别为蛋白质溶液在蛋白质溶液在280nm和和260nm处测得的吸光度值处测得的
14、吸光度值)。本法适用于微量蛋白质浓度测定,对盐类混杂的情本法适用于微量蛋白质浓度测定,对盐类混杂的情况比较合适,为简便起见,对混合蛋白质溶液,可用况比较合适,为简便起见,对混合蛋白质溶液,可用A2800.75来表示蛋白质大概浓度。来表示蛋白质大概浓度。【注意事项注意事项】由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同,由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同,显色深浅随不同蛋白质改变,因而本法只适用于蛋白质显色深浅随不同蛋白质改变,因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定,核酸对结果也有影响,尽管进行了公相对浓度的测定,核酸对结果也有影响,尽管进行了公式校正,但是不同样品干扰成分差异较大,致使式校正,但
15、是不同样品干扰成分差异较大,致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题思考题】1.紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么?紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么?2.影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些?影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些?三、三、Folin-酚法测定蛋白质浓度酚法测定蛋白质浓度【实验目的实验目的】熟悉熟悉Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。酚法测定蛋白质浓度的方法。【实验原理实验原理】Folin-酚法又称酚法又称lowry法。首先在碱性溶液中形法。首先在碱性溶液中形成铜成铜-蛋白质复合物,后与磷钼酸蛋白质复合物,后与磷钼酸-
16、磷钨酸作用,产生磷钨酸作用,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物,这中复合物在深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物,这中复合物在750nm和和660nm处有最大吸收峰,颜色与蛋白质浓度成正处有最大吸收峰,颜色与蛋白质浓度成正比,进而可以计算蛋白质浓度。比,进而可以计算蛋白质浓度。【材料、试剂、与器具材料、试剂、与器具】1.Folin-酚酚A(碱碱性性铜铜试试剂剂):20g碳碳酸酸氢氢钠钠和和4g氢氢氧氧化化钠钠双双蒸蒸水水定定容容1000ml为为储储备备液液1;0.5g五五水水硫硫酸酸铜铜1gNa3C6H5O7,定容,定容100ml,为储备液,为储备液2。将将50ml储储备备液液1和和1ml储储备备液液2混混合合
17、为为溶溶液液A,混混合合后后一一日有效。日有效。2.Folin-酚酚B:100g钨钨酸酸钠钠、25g钼钼酸酸钠钠、100g蒸蒸馏馏水水、50ml80%磷磷酸酸、100ml浓浓硫硫酸酸在在1500ml磨磨口口圆圆底底小小瓶瓶中中混混匀匀后后接接上上磨磨口口冷冷凝凝管管,回回流流10h再再加加入入硫硫酸酸锂锂150g、蒸蒸馏馏水水50ml及及液液溴溴数数滴滴,开开口口煮煮沸沸15min,冷冷却却,稀稀释释至至100ml过过滤滤,至至微微绿绿,储储存存于于棕棕色色瓶瓶。临临用用前前氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定,用用酚酚酞酞做做指指示示剂剂,据据滴滴定定结结果果,将将试试剂剂稀稀释释至至1mol/L的的酸
18、酸,冰箱保存。冰箱保存。3、标准浓度牛血清蛋白溶液、标准浓度牛血清蛋白溶液200g/ml4、721分光光度计分光光度计5、刻度吸管、刻度吸管0.5ml(1),),1ml(2),),5ml(1)6、试管、试管1.5cmX15cm8只只7、恒温水浴、恒温水浴【操作步骤操作步骤】1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取6只试管,按下表加入试剂:试 剂 012345牛血清蛋白溶液 00.20.40.60.81.0蒸馏水 4.54.34.13.93.73.5Folin-酚A1.01.01.01.01.01.0酚第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积6.0
19、6.06.06.06.06.0OD660 加入试剂加入试剂A后,混匀,室温后,混匀,室温10min,在加,在加Folin-酚酚B3.0ml,混匀后,混匀后10min,再第二次加,再第二次加0.2ml,混,混匀放置匀放置30min。于。于660nm比色,做标准曲线。比色,做标准曲线。2、样品测定、样品测定取样品取样品1ml按上表加试剂,按上表加试剂,660nm处比色,对处比色,对照标准曲线求出蛋白质浓度。照标准曲线求出蛋白质浓度。【思考题思考题】1、Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理是什么?酚法测定蛋白质浓度的原理是什么?2、影响、影响Folin-酚法测定蛋白质浓度的准确性的酚法测定蛋白质浓度
20、的准确性的因素有那些?因素有那些?四、双缩脲法四、双缩脲法 【实验目的实验目的】了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。【原理原理】蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物,在形成紫红色络合物,在540nm波长处有最大吸收。在一定浓度范围内,其颜波长处有最大吸收。在一定浓度范围内,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,可以用比色法定量色的深浅与蛋白质的浓度成正比,可以用比色法定量测定测定双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确的测定。双缩脲法通常用于需要
21、快速但不十分精确的测定。【试试剂剂和和器器材材】1.2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白溶液2.容量瓶容量瓶10ml(6)3.试管试管1.5cm15cm(8)4.双缩脲试剂:溶解双缩脲试剂:溶解0.175g硫酸铜(硫酸铜(CuSO45H2O)溶于)溶于15ml水中,在水中,在100ml容量瓶中加入容量瓶中加入30ml浓氨水、浓氨水、30ml冷蒸馏水和冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠,摇匀,饱和氢氧化钠,摇匀,室温室温1-2h定容定容100ml,摇匀备用。在搅拌下加入,摇匀备用。在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液,用水稀释到氢氧化钠溶液,用水稀释到1000ml,贮存在内壁涂以石腊的瓶
22、中。此试剂可长期保存。若贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。5.吸量管(吸量管(1ml,2ml,5ml)6.721型分光光度计型分光光度计【操作步骤操作步骤】1.绘制标准曲线绘制标准曲线取取6只试管编号,按下表加入试剂,即得只试管编号,按下表加入试剂,即得6种不同种不同浓度的蛋白质溶液。浓度的蛋白质溶液。另取试管另取试管7只,按只,按0、1、2、3、4、5、6编号,编号,1-6号分别加上述蛋白质溶液号分别加上述蛋白质溶液3.0ml0号为对照,加号为对照,加3.0ml蒸馏水分别加入,各试管中加双缩脲试剂蒸馏
23、水分别加入,各试管中加双缩脲试剂2.0ml混混匀,紫色出现后,与匀,紫色出现后,与540nm测定吸光度,闭塞测定法测定吸光度,闭塞测定法务必在务必在30min内完成,绘制蛋白质浓度内完成,绘制蛋白质浓度吸光度曲线。吸光度曲线。容量瓶编号容量瓶编号牛血清蛋白溶液牛血清蛋白溶液蒸馏水蒸馏水蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml11.0稀释至刻度稀释至刻度0.222.0稀释至刻度稀释至刻度0.433.0稀释至刻度稀释至刻度0.644.0稀释至刻度稀释至刻度0.855.0稀释至刻度稀释至刻度1.066.0稀释至刻度稀释至刻度1.22.未知样品蛋白质浓度的测定未知样品蛋白质浓度的测定取样品取样品3.0ml于试管
24、中,加双缩脲试剂于试管中,加双缩脲试剂2.0ml混混匀,于匀,于540nm处测定其吸光度,对照标准曲线,求处测定其吸光度,对照标准曲线,求出蛋白质浓度。出蛋白质浓度。【思考题思考题】1.本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较,有本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较,有那些优点?那些优点?2.若样品中有干扰测定的杂质,应该如何校正若样品中有干扰测定的杂质,应该如何校正实验结果?实验结果?实验二实验二离子交换法血清纯化离子交换法血清纯化IgG 【实验原理实验原理】DEAE-SephadexA-50(二乙氨基(二乙氨基-乙基乙基-葡葡萄糖凝胶萄糖凝胶A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用)为弱碱性阴离子交换剂
25、。用NaOH将将Cl-型转变为型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清型后,可吸附酸性蛋白。血清中的中的球蛋白属于中性蛋白(等电点为球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.857.5),其余均属酸性蛋白。),其余均属酸性蛋白。pH7.27.4的环境的环境中。酸性蛋白均被中。酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只吸附,只有有球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。【试剂与器材试剂与器材】1.DEAE-SephadexA-502.0.5mol/LHCl和和NaOH3.
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