弓形虫TgERP基因的原核表达及间接ELISA方法的建立.pdf

2023年第40卷第8期89技 术 支 撑弓形虫 TgERP 基因的原核表达及间接 ELISA 方法的建立苗书魁1，王陆宝2，陆桂丽1，汪萍1，魏玉荣1，夏俊1，魏婕1，米晓云1（1.新疆动物疫病研究重点实验室，新疆乌鲁木齐830013；2.乌鲁木齐海关，新疆乌鲁木齐830011）摘要：为原核表达弓形虫的 TgERP 基因，参照 GenBank 中弓形虫 GTl 株的 TgERP 基因序列设计引物，通过PCR 扩增分离的一株猫源弓形虫（TC 株）的 TgERP 基因，将其克隆至原核表达载体 pET-28a 中，通过 IPTG诱导表达蛋白，应用带 His 标签的重力柱纯化蛋白，采用 BCA 方法测定蛋白浓度，利用重组蛋白免疫 Balb/c 小鼠制备多克隆抗体，并对重组蛋白进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析。结果成功表达了 TgERP 蛋白，且蛋白以上清形式表达，相对分子质量约 16 ku。将纯化的重组蛋白 pET-28-TgERP 作为诊断抗原，初步建立了间接ELISA方法；利用间接ELISA、改良凝集试验（MAT）和间接血凝试验（IHA）3种方法分别检测472份羊、犬、猫血清样品，发现阳性率分别为1.0%、3.8%、3.4%，验证了建立的间接ELISA方法可区分动物感染弓形虫的途径。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。关键词：弓形虫；TgERP 基因；原核表达；反应活性中图分类号：S852.7文献标识码：A文章编号：1005-944X（2023）08-0089-05DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2023.08.017开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Prokaryotic Expression of TgERP Gene of Toxoplasma gondii and Development of an Indirect ELISAMiao Shukui1，Wang Lubao2，Lu Guili1，Wang Ping1，Wei Yurong1，Xia Jun1，Wei Jie1，Mi Xiaoyun1（1.Xinjiang Key Laboratory of Animal Infectious Diseases，Urumqi，Xinjiang830013，China；2.Urumqi Customs，Urumqi，Xinjiang830011，China）Abstract：In order to express the TgERP gene of Toxoplasma gondii by prokaryotic expression system，primers were designed with reference to the TgERP gene sequence of Toxoplasma gondii GTl strain registered in GenBank.The TgERP gene of a cat-derived Toxoplasma gondii（TC strain）was amplified by PCR，then cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a to induce and express protein by IPTG，the TgERP protein was purified by Gravitrap with His-tag，and its concentration was measured by BCA method.The Balb/c mice were immunized with the recombinant protein to prepare polyclonal antibodies，and TgERP protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.The results revealed that recombinant TgERP protein was successfully expressed in the supernatant，and its molecular weight was about 16 ku.An indirect ELISA（iELISA）was developed taking the purified recombinant protein pET-28-TgERP as a diagnostic antigen；472 serum samples from sheep，dogs and cats were detected respectively by iELISA，modified agglutination test（MAT）and indirect hemagglutination test（IHA），and the positive rates were 1.0%，3.8%and 3.4%，respectively，which verified that the established iELISA could be used to distinguish the pathways of animal infection with Toxoplasma gondii.A foundation was thus laid for future development of a rapid diagnostic method for toxoplasmosis and corresponding vaccines.Key words：Toxoplasma gondii；TgERP gene；prokaryotic expression；reactivity收稿日期：2023-05-23修回日期：2023-06-15基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2016D01A001）通信作者：陆桂丽。E-mail：90技 术 支 撑弓 形 虫 病（toxoplasmosis）是 由 弓 形 虫（Toxoplasma gondii）引起的一种全球性流行的人兽共患寄生虫病1。据报道2-3，我国普通人群的弓形虫抗体阳性率为 8.2%，其中孕妇为 8.6%。人类弓形虫感染主要通过摄入未煮熟或含有活组织囊肿的生肉，或通过摄入被弓形虫卵囊污染的食物或水4-5。在健康人群和其他大多数动物宿主中，弓形虫很少引起严重症状，但对某些患者可引起淋巴结病或眼弓形虫病6，感染孕妇后，可对胎儿造成严重损害，导致出现死胎，胎儿畸形、脑积水、脑钙化，以及弱智儿等7。猫及猫科动物是弓形虫的唯一终末宿主，弓形虫在其体内可进行有性繁殖，形成卵囊8。弓 形 虫 胚 层 发 育 相 关 蛋 白（Toxoplasma gondii embryogenesis-related protein，TgERP）是 弓 形 虫卵囊发育阶段的特有蛋白，是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，在卵囊上含量丰富。目前对 TgERP蛋白的研究较少，该蛋白在弓形虫中的功能尚不清楚，但在植物、无脊椎动物和微生物中，被认为其在抵御各种恶劣外界环境方面有着至关重要的作用9-10。近年来随着人们生活水平的提高，家庭饲养的宠物猫数量越来越多。1 只感染弓形虫的猫，每天可排出数百万个弓形虫卵囊，最高可达 1 000万个11。更重要的是，流浪猫四处走动，对动物和人类健康造成了严重威胁12。据弓形虫病流行病学调查13，弓形虫感染率与接触传染源概率成正比。本试验将分离的一株猫源弓形虫的 TgERP基因插入到原核表达载体 pET-28a 中，以上清形式表达 TgERP 蛋白；将纯化的重组蛋白 pET-28-TgERP 作为诊断抗原，初步建立了间接 ELISA 方法。该方法能区分动物感染弓形虫是通过食入猫粪便中的卵囊感染的，还是通过摄入未煮熟或含有活组织囊肿的生肉感染的，为弓形虫病快速诊断与防控提供了技术支撑。1材料与方法1.1虫株和血清弓形虫 TC 株，2012 年 4 月从一只 2 岁雌性宠物狸猫中分离出。472 份血清样品，由本实验室-70 保存备用，包括采自新疆阿勒泰地区的绵羊血清样品 150 份，采自昌吉地区的绵羊血清样品203 份，采自乌鲁木齐市的宠物犬血清样品 84 份、宠物猫血清样品 35 份。1.2主要试剂弓形虫改良凝集试验（MAT）诊断抗原和间接血凝试验（IHA）试剂盒，由兰州兽医研究所提供；无水乙醇、Tris、Gly、SDS、脱脂奶粉、20PBS solution、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（质量比37.5:1）溶液、APS、TEMED、T-20、终止液和PBS缓冲液等，均购自上海生物工程技术有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和 Anti-Mouse IgG（whole molecule）-Peroxidase antibody produced in rabbit，购自 Sigma 公司；蛋白纯化试剂盒 His Gravitrap 和 His 缓冲液试剂盒，购自 GE 公司；TaqDNA 聚合酶，各种限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，IPTG 和 PCR 试剂盒，均购自 TaKaRa 公司；Prestained Protein Ladder，购自 Thermo 公司；大肠杆菌感受态细胞 DH5 和 BL21（DE3），购自Promega 公司；原核表达载体 pET-28a，购自大连宝生物工程有限公司；ELISA 96 孔检测板，购自COSTAR 公司；TMB 单组份显色液，购自索莱宝生物科技有限公司。1.3引物设计与合成根据 NCBI 序列号码 LN714502，下载弓形虫TgERP 基因序列（315 bp）；采用 DNAstar 软件设计 TgERP 基因上游和下游引物的酶切位点，分别为 EcoRI 和 XhoI；采用 Oligo 7.0 软件设计 TgERP基因引物（F：5-CGGAATTCATGGCGACCGAG-CACTCACAC-3；R：5-CCGCTCGAGCTAGCC-AAGCTTTTCTTGAACCTT-3）。引物由上海生物工程技术有限公司合成。1.4DNA 基因组提取弓形虫 TC 株腹水离心后用生理盐水清洗 2次，用 500 L 生理盐水溶解弓形虫，将蛋白酶 K按照 100 g/mL 加入到 TC 虫株缓冲液中，60 消化 30 min，95 加热 10 min，使蛋白酶 K 完全失活；将此溶液作为 TC 虫株 DNA 基因组样本，2023年第40卷第8期91技 术 支 撑置-20 保存备用。1.5TgERP 基因克隆以 TC 虫 株 基 因 组 为 模 板，用 PCR 扩 增TgERP 基因。PCR 反应条件：94 4 min；94 30 s，57 30 s，72 30 s，35 个循环；72 延伸 10 min。对 PCR 产物以 1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.6阳性重组质粒构建双酶切 TgERP 基因和 pET-28a 载体，并进行胶回收和纯化；将纯化的 TgERP 基因和 pET-28a载体 16 连接过夜，将连接产物转化到 DH5 感受态细胞中；将转化产物涂抹在含有 25 g/mL Kan的 LB 固体培养基上，37 倒置培养过夜；挑琼脂板上的单个菌落接种到含有 Kan 的 LB 液体培养基里，37、250 r/min 摇菌过夜，第 2 天提取质粒；用 PCR 和双酶切鉴定重组质粒，然后将鉴定的阳性重组质粒转化到 BL21（DE3）感受态细胞中，送往上海生物工程技术有限公司进行菌种测序，将其命名为 pET-28-TgERP。1.7重组蛋白 SDS-PAGE 分析将阳性重组菌 pET-28-TgERP 37、250 r/min 振荡培养至 A=0.60.8 时，加入 1 mmol/mL 的IPTG，37 诱导表达 4 h，同时用诱导表达的载体pET-28a 做阴性对照；收集菌体用 PBS 溶解，超声破碎，12 000 r/min 离心 10 min；分装上清，将沉淀用 PBS 溶解；取表达的蛋白上清和沉淀溶解液各 90 L，加入 30 L 4SDS 上样缓冲液，煮沸10 min，取 15 L 样品进行 SDS-PAGE 分析。1.8重组蛋白纯化按照 1.7 的方法扩大培养和诱导阳性菌液pET-28-TgERP 300 mL，对超声破碎的上清应用GE 公司的 His 重力柱和 His 缓冲液试剂盒，按照说明书步骤进行蛋白纯化。将蛋白通过与 Ni-NTA柱特异性吸附及咪唑（20、60、100、5 000 mmol/L）梯度纯化，收集各梯度浓度的咪唑液体 1 mL/管，通过 SDS-PAGE 进行分析。1.9重组蛋白浓度测定应用 BCA 法测定纯化的蛋白浓度，根据样品测定的A562 nm平均值，应用标准曲线计算样品浓度。1.10制备抗重组蛋白阳性血清将纯化的蛋白用 PBS 稀释后，与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫 3 只 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠，100 g/只腹腔注射 0.2 mL。在一免 14 和 28 d 后，用弗氏不完全佐剂等体积乳化抗原加强免疫。免疫42 d 后断尾采血，分离血清，用间接 ELISA 方法检测抗体水平，对抗体效价高的老鼠眼球采血分离血清。1.11重组蛋白 Western blotting 分析将纯化的重组蛋白进行 SDS-PAGE 后，电转至 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉封闭，加入 1:500的一抗震荡孵育 2 h，PBS 液洗涤 3 次，加入1:2 500 的二抗孵育 2 h，洗涤 3 次，用 DAB 显色液显色。1.12间接 ELISA 检测方法建立将纯化的重组 TgERP 蛋白作为诊断抗原，包被 ELISA 板，采用棋盘滴定法确定抗原和血清的最佳稀释度。将抗原使用包被液从 200 ng 稀释到25 ng，然后包被到 96 孔的 ELISA 板中。重组蛋白pET-28-TgERP 免疫老鼠的阳性血清和阴性血清从1:100 稀释到 1:3 200，根据阳性和阴性的 A450 nm比值进行判断，比值 2.1 判为阳性，反之为阴性。对兔抗鼠的 HRP-IgG 稀释度、反应时间和其他条件进行优化。具体步骤：将包被好的酶标板 100 L/孔盖好，37 孵育 2 h；弃去包被液，PBST 洗涤 3次，按250 L/孔加入5%的封闭液，37 孵育1 h；弃掉封闭液，用 PBST 洗涤 3 次，按 100 L/孔加入不同倍比稀释的阳性和阴性血清，并加入对照样品，37 孵育 45 min；弃去血清，用 PBST 洗涤 3次，按100 L/孔加入稀释的兔抗鼠HRPIgG二抗，37 孵育 45 min；弃去二抗，用 PBST 洗涤 3 次，TMB 显色 35 min；按 100 L/孔加终止液，在酶标仪上读取吸光值 A450 nm。1.13间接 ELISA、MAT 和 IHA 方法检测血清样品根据文献 14 采用 MAT 方法，按照试剂盒说明书应用IHA方法和1.12建立的间接ELISA方法，分别检测 472 份羊、猫和犬血清样品。92技 术 支 撑2结果2.1PCR 扩增 TgERP 基因以提取的弓形虫基因组为模版，成功通过 PCR扩增出TgERP基因，目的片段大小为315 bp（图1）。2.2重组质粒鉴定以重组表达质粒 pET-28a-TgERP 为模板进行PCR 扩增，得到与预期大小相符的 315 bp 目的片段；重组表达质粒经 XhoI 和 EcoRI 双酶切后，得到与预期大小相符的 315 bp 的 TgERP 基因和 约 5 400 bp 的空载体 pET-28a（图 2），表明TgERP 基因被成功插入到表达载体中。经测序结果比对，阳性重组表达质粒 pET-28a-TgERP 与 GTl株 TgERP 基因序列完全一致。2.3重组蛋白诱导表达和纯化重组蛋白 pET-28-TgERP 经 IPTG 诱导后进行SDS-PAGE 分析，发现表达产物为上清表达，大小约 16 ku，与预期大小一致，阴性对照没有出现该条带。应用咪唑梯度浓度纯化蛋白，结果发现表达产物在 60 和 500 mmol/L 咪唑浓度中被洗脱。2.4重组蛋白的浓度测定根据样品测定的 A562 nm平均值，应用标准曲线计算出检测样品的蛋白质质量浓度，发现重组蛋白pET-28-TgERP 质量浓度最高达到 1.6 mg/mL。2.5间接 ELISA 检测方法建立筛选的重组蛋白 TgERP 抗原包被浓度最终为50 ng/孔，阳性血清最佳稀释度为 1:200，抗鼠二抗最佳稀释度为1:15 000，封闭液为5%的脱脂奶粉，阴性血清 A450 nm均值为 0.106。检测样品 A450 nm0.212，判定为弓形虫抗体阳性，反之为阴性。2.63 种方法检测血清样品应用间接 ELISA、MAT 和 IHA 方法分别检测了 472 份羊、猫和犬的血清样品，发现弓形虫抗体阳性率分别为 1.0%、3.8%和 3.4%（表 1）。3讨论弓形虫的主要感染途径是口腔感染、先天性感染和血液循环系统感染。MAT 和 IHA 两种方法M.DL 2 000 DNA Marker；14.样本。图 1TgERP 基因 PCR 扩增结果M1.DL 15 000 DNA Marker；M2.DL 2 000 DNA Marker；1.酶切重组质粒；2.PCR 扩增重组质粒。图 2重组质粒 pET-28-TgERP 的鉴定结果M.蛋白质 Marker；13.20 mmol/L 咪唑洗脱；47：60 mmol/L 咪唑洗脱；89.500 mmol/L 咪唑洗脱。图 3重组蛋白 pET-28-TgERP 的纯化结果表 13 种检测方法对比结果样品名称样 品数量/份3 种方法检测的阳性率/%（阳性样品数/份）间接 ELISAMATIHA羊血清3531.0（2）4.5（16）4.0（14）犬血清841.2（1）1.2（1）1.2（1）猫血清352.9（1）2.9（1）2.9（1）总计4721.0（4）3.8（18）3.4（16）2023年第40卷第8期93技 术 支 撑可以检测动物通过任何一种途径感染弓形虫情况，包括是通过食用了动物组织包囊还是食用了猫科动物粪便中的卵囊，而以 TgERP 蛋白为包被抗原建立的间接 ELISA 方法只能检测动物从卵囊途径感染弓形虫情况。TgERP 是弓形虫卵囊发育阶段的特有蛋白，是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，为此本研究原核表达了 TgERP 蛋白，并以该蛋白建立了间接 ELISA 方法。本研究应用建立的间接ELISA 以及 MAT 和 IHA 方法，分别检测了 472 份羊、犬、猫血清样品，其中在 353 份羊样品中，间接 ELISA 方法检出 2 份阳性，MAT 和 IHA 分别检出 16 份和 14 份阳性，进一步验证了羊感染弓形虫的主要途径是通过食用含有弓形虫的组织包囊，而很少通过食用含有卵囊的食物感染。MAT 和 IHA检出的弓形虫阳性率（4.5%）比 IHA（4.0%）略高，这可能是在人为判定凝集点（抗原抗体结合）上存在误差。3 种方法检测犬和猫血清样品的检测结果一致，证明检出的阳性动物是通过食入猫科动物粪便中的卵囊感染的。随着人们生活水平的提高，家庭饲养宠物犬猫数量越来越多，流浪犬猫也随之增多。这些流浪宠物每天徘徊在人们生活的地方，对人类健康造成了威胁。新疆是全国畜牧业生产基地，有大量的草原、牧区，羊肉和猪肉是该地区人们生活食用的主要肉类。弓形虫流行病学调查显示13，弓形虫感染率与接触传染源概率成正比。人类和动物关系密切而复杂，在食物链中互相竞争又互相依存。本研究建立了间接 ELISA 方法，并应用 MAT 和 IHA方法作对照，目的是建立能区分动物感染弓形虫途径的方法，便于对弓形虫病采取有效的防控措施。据相关报道9-14，TgERP 蛋白序列变异率为 00.96%。本研究将 TgERP 蛋白氨基酸序列在NCBI 数据库中进行比对，显示变异率为 0，与田维鹏等9-10的比对结果相近，说明该蛋白高度保守，可作为血清学诊断方法的候选抗原，也可作为疫苗研究的候选抗原。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。参考文献：1 MONCADA P A，MONTOYA J G.Toxoplasmosis in the fetus and newborn：an update on prevalence，diagnosis and treatmentJ.Expert review of anti-infective therapy，2012，10（7）：815-828.2 DONG H，SU R，LU Y，et al.Prevalence，risk factors，and genotypes of Toxoplasma gondii in food animals and humans（20002017）from ChinaJ.Frontiers in microbiology，2018，9：2108.3 LI K，WANG M，ZHANG H，et al.Epidemiology of Toxoplasma gondii infection in native tibetans in Tibet，ChinaJ.Acta 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