功能核酸侧流层析传感器及其食品安全快速检测应用.pdf

QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期0引言据世界卫生组织统计袁全球约有 6 亿人在食用受污染的食物后健康状况不佳袁每年超 42 000 人死亡1-2遥 传统的测试分析方法包括色谱法尧质谱法和实时荧光定量 PCR尧酶联免疫吸附测定袁虽然这些方法在检测食品污染方面成熟可靠袁 但耗时长尧成本高尧操作复杂袁这些弊端严重制约了从农田到餐桌有效防线的及时建立遥 功能核酸侧流层析传感器作为一项快速检测技术袁不受环境制约袁可以现场检测食品污染袁能够更可靠尧更快速地检出危害袁确保食品安全遥1功能核酸侧流层析传感器概述功能核酸是一种具有特殊功能的核酸序列袁可以特异性结合目标物质或催化反应袁具有特异性高尧稳定性好尧体积小尧成本低尧易于化学修饰尧靶标范围广泛尧 从金属离子到全细胞等优点袁 包括核酸适配体尧三链核酸尧G-四链核酸尧切割核酸酶尧反义寡核苷酸尧异种核酸渊XNAs冤尧金属碱基对 DNA 和点击化功能核酸侧流层析传感器及其食品安全快速检测应用汪德颖1袁2齐小花1盛万里3裴佳欢1袁2邹明强1*渊1.中国检验检疫科学研究院&国家市场监管重点实验室渊食品质量与安全冤北京100176曰2.北京工业大学环境与生命学部曰3.呼和浩特海关技术中心冤摘要院食品消费的全球化及食源性疾病的增加袁凸显了食品危害监测和食品安全评估的重要性袁灵敏尧便捷尧低廉的生物传感快速检测技术成为食品安全研究热点遥功能核酸渊FNAs冤由于具有高结合亲和力尧特异性识别和催化活性尧易于修饰等多种功能袁被集成到侧向层析分析中构建简单且可持续的纸基层析生物传感器袁以实现快速尧无抗体尧经济高效的靶标检测遥 本文主要介绍基于不同功能核酸的侧流层析传感器袁包括基本原理尧从样品预处理到信号转导的构建过程及在食品安全检测中的应用袁对未来研究方向进行展望袁以期为有效预防控制食品安全问题提供一种生物传感快速检测路径遥关键词院功能核酸曰核酸侧流层析传感器曰快速检测曰食品安全中图分类号院TS207曰TP212Functional nucleic acid lateral flow chromatography sensorand its rapid food safety detection applicationWANG Deying1袁2袁QI Xiaohua1袁SHENG Wanli3袁PEI Jiahuan1袁2袁ZOU Mingqiang1*渊1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine&Key Laboratory of Food Quality and Safety for State Market Regulation袁Beijing袁100176袁China曰2.Department of Environment and Life袁Beijing University of Technology曰3.Technical Center of Hohhot Customs District冤Abstract院The globalization of food consumption and the increase of foodborne diseases highlight the importance of foodhazard monitoring and food safety assessment.Sensitive袁convenient and cheap biosensing rapid detection technology has be-come a hotspot of food safety research.Functional nucleic acids 渊FNAs冤袁due to their high binding affinity袁specific recogni-tion and catalytic activity袁easy modification and other functions袁are integrated into the lateral chromatography analysis tobuild a simple and sustainable paper base analysis biosensor袁in order to achieve rapid袁antibody-free袁cost-efficient target de-tection.This paper mainly introduces based on different functions of nucleic acid lateral flow chromatography sensor袁includ-ing the basic principle袁from the sample pretreatment to the construction process of signal transduction and the application infood safety detection袁for the future research direction袁in order to effective prevention and control of food safety problemsprovide a biological sensing rapid detection pathway.Keywords院Functional nucleic acid曰Nucleic acid lateral flow chromatography sensor曰Rapid detection曰Food safety第一作者 Email院曰*通信作者 E-mail院基金项目院海南省重点研发计划项目渊ZDYF2021SHFZ069冤曰国家重点研发计划项目渊2022YFF0607903冤曰中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目渊2022JK18冤收稿日期院2023-08-30窑24窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING2.1样品预处理检测食品样品前袁通常要进行提取尧纯化和浓缩目标物的预处理袁 以提高后续 LFB 检测的灵敏度尧准确度和可重复性遥 适配体功能化磁珠渊AFMBs冤和适体功能化亲和柱渊AFACs冤可用于样品靶标的提取和富集袁样品垫可控制样品释放袁消除了不同样品之间组分差异袁并作为样品基质的过滤器遥2.2NC 膜涂装方法不能简单地通过空气干燥将核酸涂布在 NC 膜上袁 因为它们可能会被毛细管力驱动的流动样品液冲走遥 适当的涂覆方法包括亲和偶联尧共价结合尧诱捕固定用来确保 FNAs 在 NC 膜上稳定分布袁 以保持其亲和力或催化活性遥2.3靶标识别核酸侧流层析传感器的靶标识别技术分为 野核酸类靶物质冶和野非核酸类靶物质冶袁其识别原理取决于不同 FNAs 和靶标各自的特征袁 这些因素显著影响检测性能遥2.3.1基于适配体的 LFB三明治夹心反应形式通常用于检测大分子靶标袁例如蛋白质尧病原体和病毒遥 它具有多个结合位点袁 可以同时与一对适配体或适配体和抗体组合结合袁形成三明治状结构遥 通常袁三明治格式的 LFB 表现出野开启冶信号袁主要识别元件作为捕获探针固定在 T 线上袁次要识别元件与信号报告器耦合作为检测探针遥 目标物存在情况下袁形成野检测探针-目标物-捕获探针冶三明治复合物袁在 T 线上表现出可检测的信号10遥竞争性反应形式通常用于检测只有一个结合位点或一种可用适体的小分子袁如霉菌毒素尧抗生素尧农药和生物化合物遥当与特定的适配体探针结合时袁靶标和竞争物之间会发生竞争袁产生野关闭冶信号11遥为获得最高的竞争反应灵敏度袁 需要调整竞争物的结构和序列袁同时优化适配体和竞争物浓度比遥学键核酸等丰富的形态结构3-5遥功能核酸侧流层析传感器 渊Functional nucleicacids lateral flow biosensor袁FNA-LFB冤 集成了功能纳米技术和功能核酸技术6袁能够克服免疫侧流层析传感器靶标范围局限尧抗体蛋白热稳定性较差7尧抗体不可避免的批次差异尧突破抗体进行荧光标记尧酶标记或结构可变性设计时复杂的修饰尧纯化瓶颈8遥2功能核酸侧流层析传感器构建功能核酸侧流层析传感器通过 野检测形式冶野靶标识别技术冶野信号转导技术冶野靶标放大技术冶野定量分析系统冶5 个环节构建袁检测形式主要分为野极简型冶 单重检测形式尧野多线型冶 多重检测形式尧野多条型冶多重检测形式尧野多点型冶多重检测形式以及野密闭性冶集成检测形式遥 FNAs 在侧流层析传感器的样品预处理尧捕获探针固定尧目标识别尧信号放大和信号转导都表现出多种功能袁如图 1 所示3遥LFB 由样品垫尧共轭垫尧硝化纤维素膜渊NC 膜冤尧吸收垫和粘性背卡组成袁如图 2 所示9遥图 1FNAs 参与构建 LFB 示意图Fig.1Schematic of FNAs involved in constructing the LFB图 2侧流层析传感器组成示意图Fig.2Schematic diagram of the lateral flow chromatographic sensor composition窑25窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期2.3.2基于 DNAzyme 核酶的 LFBDNAzyme 核酶袁尤其是 RNA 切割 DNAzyme 核酶袁 以其显著的结合亲和力和特异性被广泛用于金属传感遥 在基于 RNA 切割 DNAzyme 核酶的 LFB中袁酶链通过靶标识别和结合被激活袁 以切割底物链上的 RNA 并释放 ssDNA袁ssDNA 可以直接捕获在条带上袁或扩增以进行扩增子捕获产生可检测的信号12遥2.3.3基于反义寡核苷酸的 LFB基于反义寡核苷酸的 LFB 通常根据 Watson-Crick 碱基配对原理用于基因组样品测试遥反义寡核苷酸探针渊DNA/RNA冤与靶核酸序列互补袁通过杂交实现特异性和准确识别捕获靶标遥 传统的基于杂交的 LFB 采取竞争性13和夹心14反应形式进行核酸检测遥 此外袁重组酶聚合酶扩增渊RPA冤15和催化发夹组装渊CHA冤16等靶标扩增策略也已集成到基于杂交的LFB 中袁作为影响后续检测的关键步骤遥传统 LFB 直接检测基因扩增产物袁由于引物二聚体的形成袁会产生假阳性信号遥簇状规则间隔短回文重复序列渊CRISPR冤/Cas 系统袁由于其优异的 ds鄄DNA 识别能力袁包含 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12系统袁 已被整合到 LFB 中遥 在基于 CRISPR/Cas9 的LFB 中袁具有特殊设计的锚定位点的扩增子 Cas9/sgR鄄NA 复合物通过形成夹心结构在试纸上捕获袁 产生野开启冶信号17-18遥 CRISPR/Cas12 系统在 dsDNA 识别后显示出反式切割活性袁切割的 ssDNA 报告基因不能继续在试纸上捕获袁产生野关闭冶信号19遥YANG 等20设计 Leptotrichia wadei渊Lwa冤Cas13a袁与电化学方法相结合袁检测到阿托摩尔浓度的 SARS-CoV-2 基因组袁无需靶标预扩增袁LwaCas13a 酶具有增强的侧支活性袁可随时集成到其他基于 Cas13a 的平台用于核酸的超灵敏检测遥2.3.4基于 XNA 的 LFBXNA 是化学合成的具有修饰的糖磷酸骨架或碱基核酸类似物袁如肽核酸渊PNA冤尧磷酸二胺吗啉基低聚物渊PMO冤尧苏糖核酸渊TNA冤和己醇核酸渊HNA冤遥基于 XNA 的 LFB 遵循 Watson-Crick 碱基配对原理袁但由于其引进了修饰的组分袁因此在 XNA-DNA杂交过程中表现出比传统 DNA-DNA 杂交更高的亲和力尧稳定性和选择性遥2.3.5基于金属碱基对的 LFB金属碱基对 DNA 代表具有特定核碱基的核酸袁这些核碱基可以通过配位键选择性地与金属离子结合袁形成强烈的金属-核碱基错配遥 富含 T/C 的 DNA可以选择性结合 Hg2+/Ag+形成 T-Hg2+-T 和 C-Ag+-C错配21遥 通过使用靶标识别诱导的核碱基错配启动核酸扩增产生的扩增子随后参与基于杂交的 LFB遥2.3.6基于点击化学的 LFB点击化学连接核酸结合了铜催化叠氮化物/炔烃环加成渊CuAAC冤的高选择性和催化活性优点以及核酸的多功能性22遥CuAAC 反应与核酸结合触发核酸的构象变化袁扩增或杂交23袁有助于更稳定和灵敏地检测铜离子遥在基于点击化学的 LFB 中袁2 个寡核苷酸分别用叠氮化物和炔基团修饰袁Cu+的存在促进了2 个修饰片段的连接袁偶联的 ssDNA 在 T 线上进一步捕获袁通过互补杂交或 SA-生物素键形成夹心复合物遥2.4信号放大核酸侧流层析传感器的信号转导模式分为比色信号尧荧光信号尧磷光信号尧电化学信号和化学发光信号等24袁每种信号都基于相应的纳米颗粒或基团作为信号元件遥当检测的靶标物质浓度较低时袁往往需要靶标放大技术与核酸侧流层析传感器联用遥FNA-LFB 中通常使用核酸扩增方法增强靶标袁通过富集或改进信号分子进行信号探针放大遥2.4.1变温放大方法PCR 是一种经典且广泛使用的核酸扩增方法遥基于半保守复制原理袁在 DNA 聚合酶和 dNTP 引物存在下袁通过野变性-退火-延伸冶循环袁对 DNA 模板进行扩增产生 dsDNA 扩增子遥 标记的 DNA 扩增子通常与 LFB 一起使用袁使用标记的引物进行进一步分析遥 许多升级 PCR 版本袁如比例竞争定量 PCR渊PCQ-PCR冤袁对流 PCR渊cPCR冤袁双超级 PCR渊DSPCR冤和超快光子 PCR渊UPPCR冤袁已经构建以实现更精准和易于使用的核酸扩增25遥2.4.2等温扩增方法FNA-LFB 中采用了酶催化法和无酶法 2 类等温扩增方法遥酶催化等温扩增方法袁将具有独特活性和具有特定序列和结构的引物/模板与靶核酸在恒定的最佳反应温度下孵育袁 产生许多单链或双链扩增子连接到许多化学分子如生物素尧罗丹明尧地高辛遥环介导等温扩增渊LAMP冤袁RPA袁 指数放大反应渊EX鄄PAR冤和 Exo III 介导的等温放大已被集成到 LFB中以进行信号放大遥 无酶等温扩增方法使用靶标结合诱导的构象变化和立足点原理将 CHA 和发夹触发的 DNA 酶切割整合到 FNA-LFB 中26遥2.4.3信号分子富集信号分子可以通过核酸杂交尧 扩增子的生物素化 dUTP尧介孔二氧化硅和 FNA-LFB 中的病毒纳米颗粒富集遥 单个 AuNP 探针在 LFB 中的灵敏度有限袁 因此袁 已经用修饰的互补寡核苷酸合成了双AuNP 探针袁并分别分配在 2 个共轭垫上遥 样品溶液窑26窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING3.1食源性致病微生物检测大肠杆菌 O157院H7尧沙门氏菌尧单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌是导致大多数食源性暴发的主要病原体遥 TASBASI 等32设计了一种基于适配体门控和 TMB 负载介孔二氧化硅纳米颗粒的LFB 检测鸡肉中的单核细胞增生李斯特菌袁LOD 为53 cell/mL遥 GAO 等33将等温链交换扩增渊SEA冤和LFB 结合袁以 10 CFU/mL 的目视检测限准确测定婴幼儿配方奶粉中的克罗诺杆菌属遥 QU 等34将 HCR多连体 渊mHCR冤 与食源性沙门氏菌 16S rRNA 偶联袁可检测到低至 53.65 CFU/mL 的沙门氏菌遥3.2生物毒素检测生物毒素是在活细胞或生物体内产生的有害物质袁包括霉菌毒素尧植物毒素尧细菌毒素和海洋毒素遥 ZHU 等35设计了一种靶适配体抗原和靶适配体互补链双竞争 LFB袁用于食品和饲料中的黄曲霉毒素渊AFB1冤检测袁其 LOD 为 0.1 ng/mL遥 WU 等36采用同源适配体组合与 茁-凝集素和 Fe3O4Au 核壳纳米颗粒结合袁通过磁富集策略和酶信号扩增开发了一种超灵敏的LFB袁用于痕量茁-凝集素检测遥LOD为8fM袁比没有磁聚焦的类似测定低 1 000 倍遥3.3农兽药残留检测滥用抗生素和杀虫剂严重影响着自然环境和人类健康袁采用基于适配体的 LFB 可以确保农产品的安全性遥 以适体修饰的 AuNPs 作为报告探针袁寡核苷酸 DNA1 修饰的 AgNPs 作为信号放大元件袁LIU等37开发了一种快速尧廉价的 LFB袁用于现场检测蜂蜜尧牛奶和奶粉中的卡那霉素遥 DNA1 与固定在 T 系上的核酸适配体和DNA2部分互补袁形成AgNP-DNA1-apt-AuNPs 复合物并捕获在试纸上袁 显示出比传统的基于 AuNP 的 LFB 更深的红色条带袁视觉检出限为 35 nM袁 扫描读数仪最低检出限为 0.077 8 nM遥CHENG 等38构建了荧光适配体 apta-LFB袁用于同时检测毒死蜱尧二嗪磷和马拉硫磷袁该方法集成了更高特异性和稳定性的荧光 apta-LFB 和零背景信号读出智能手机光谱阅读器袁用于现场定量多种农药遥3.4金属离子检测人造 DNA 酶和适配体可选择性地与金属离子结合袁导致结构和功能发生变化袁通过分析设备能够转换为可测量的信号41遥 ZHOU 等39设计了 1 个DNA流过袁通过互补杂交重新水化和偶联 2 种 AuNPs袁在检测区域产生更深的红色信号27遥2.4.4信号分子增强信号分子增强可以通过酶催化的显色反应来实现遥 具有 G4 结构的 DNAzymes 核酶显示出过氧化物酶样活性袁因为更简单袁稳定性更好袁成本相对较低优于 HRP 等蛋白质酶遥 CHENG 等28设计了一种DNAzymes 核酶催化扩增方法来增强 AuNP 信号袁有效地提高了 FNA-LFB 检测灵敏度袁单个 AuNP 可以加载数百个 DNAzymes 核酶遥2.5信号转导信号转导使用各种可检测信号包括比色信号尧荧光信号尧表面增强拉曼光谱尧热信号和电化学信号量化不可见的反应遥FNA-LFB 的传统信号转导方法通常采用化学分子或纳米材料进行信号传导袁例如院AuNPs尧纳米酶尧荧光染料尧染料掺杂纳米颗粒和荧光纳米颗粒29-30遥3食品安全快速检测应用核酸侧流层析传感器已广泛应用于食品安全快速检测中渊图 3冤31遥 靶标物质涉及食源性致病微生物尧生物毒素尧农兽药残留尧重金属离子尧非法添加尧肉类掺假以及生物技术食品等遥图 3核酸侧流层析传感器在食品安全检测中的应用Fig.3Application in the rapid detection of food safety窑27窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期序列和 2 个发夹探针袁通过核酸外切酶渊Exo III冤辅助级联信号放大袁Hg2+存在下袁DNA 序列与发夹探针结合袁产生的富 G序列通过与N-甲基间卟啉IX渊NMM冤结合形成 G-四链体结构作为信号传感器袁 检测限为10 fM遥 LI 等40采用无荧光标记单链DNA 和 SYBRGreen I 快速检测 Hg2+袁LOD 为 3 nM袁SYBR Green I仅当存在 Hg2+情况下嵌入双螺旋结构的凹槽中袁产生强烈的荧光遥3.5掺假检测掺假经常发生在食品工业中袁威胁人类健康袁通常使用物种特异性基因进行食品真实性检测遥 QIN等41整合多种聚合酶链扩增渊mPCR冤和 LFB 来检测牛肉中的多种掺假成分遥 掺假组分的引物组具有不同的核酸标签渊NAT冤袁使扩增子能够在 2 个相反的末端具有特定的摆动序列遥该方法能够同时从牛肉中准确识别鸡肉尧 鸭肉和猪肉掺假成分袁LOD 低至0.01%渊wt%冤遥 WANG 等15开发了一种基于快速等温重组聚合酶扩增渊RPA冤的 LFB 用于牦牛奶检测袁可在 40 min 内检测低至 5%的牦牛奶遥 ZHANG 等42使用标签标记多重环介导等温扩增渊TM-LAMP冤和三叉戟状 LFB 建立了智能生物传感器袁用于马和驴产品的真伪检测袁提供了一个高通量和现场识别平台遥3.6转基因食品检测由于存在多种性状袁 准确和现场检测堆叠的转基因生物是当下难题遥 LI 等43构建了通用 FNA 侧流磁试纸条渊MTS冤袁将转基因玉米 MON810 作为生物传感器的双链模型靶标袁以磁性纳米颗粒渊MNPs冤为信号输出元件与阻断超 PCR渊BS-PCR冤相结合袁指数 PCR 扩增和磁性增敏技术提高了 MON810 对单个拷贝的检测灵敏度遥 CHENG 等44结合事件特异性标签标记的多重 LAMP 技术检测转基因大豆的内参基因和两段侧翼序列袁 实现了堆积转基因大豆快速尧高灵敏检测袁检测限为 0.1%渊w/w冤遥4展望近年来袁 核酸侧流层析传感器在开发固定化FNAs 和提高其功能尧多样和有效信号读出等领域取得了快速进展遥然而袁大多数已发表的功能核酸侧流层析传感器无法满足 WHO 为生物传感器规定的理想野ASSURE冶标准院价格合理尧灵敏尧特异性尧用户友好尧快速尧坚固尧无需设备且可交付给最终用户曰其次袁大多数应用涉及单靶点检测袁很少有研究充分利用核酸结构来开发多重检测方法遥因此袁未来需要提高 FNAs 筛选效率袁开发更有效的分区方法尧简单的实时监控策略和自动选择设备曰 将 FNAs 与其他有益的识别元件渊如受体尧MIP 等冤相结合袁开发高性能FNAs-LFB曰重点将反应模块集成到单个可以处理原始样品并产生易于解释的准确读数的侧流层析传感器中袁如 PGM 和 PST袁发展远程数据收集和传输曰高通量检测是 FNAs-LFB 发展的共性需求袁需要开发更强大的检测模式袁 以及相应的多通道和便携式读出设备遥参考文献1Food safety袁WHO EB/OL.渊2020-04-30冤2023-08-28http院/www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/food-safe鄄ty.2LUO Y B.Functional nucleic acid based biosensors forfood safety detection M.Singapore袁Springer Singapore袁2018院1-14.3WANG J袁ZHU L J袁LI T S袁et al.Multiple functionali鄄ties of functional nucleic acids for developing high-per鄄formance lateral flow assaysJ.TrAC Trends in Analyti鄄cal Chemistry袁2022袁148院116529.4LIU R B袁ZHANG F Y袁SANG Y X袁et al.Screening袁i鄄dentification袁and application of nucleic acid aptamersapplied in food safety biosensingJ.Trends in Food Sci鄄ence&Technology袁2022袁123院355-375.5DU Z H袁LI X Y袁TIAN J J袁et al.Progress on detectionof metals ions by functional 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