功能化氧化石墨烯携带PD-L1 siRNA抑制肝癌细胞的恶性生物学行为.pdf
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1、激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.4Aug.2023第 32 卷第 4 期2023 年 8 月收稿日期:2023-05-05;修回日期:2023-05-29。基金项目:湖南省研究生科研创新项目(QL20210136);2021年湖南省企业科技特派员项目(2021GK5015);湖南省自然科学基金面上项目(2021JJ30453);国家自然科学基金面上项目(81872256)。作者简介:李志伟,博士研究生。通信作者:李立民,讲师,主要从事生物材料与医用电子学方面的研究。E-mail:。功能化氧化石墨烯携带PD-L1 siRNA抑制肝癌 细胞的恶性生物学行
2、为李志伟a,单丽红a,刘曦冉a,闵洋a,丁小凤a,李立民b*(湖南师范大学 a.生命科学学院基因功能与调控研究室;b.工程与设计学院,长沙 410081)摘要:程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)信号通路主要参与免疫负调控作用,且在许多类型的肿瘤的恶性发展中具有关键作用。PD-L1的高表达可促进肝细胞癌(HCC)的侵袭,提高肿瘤复发的风险。另外,PD-L1常作为免疫检查点的阻断靶点,主要通过单抗将其中和,引发抗肿瘤免疫反应。因此,PD-L1是HCC免疫治疗中极具潜力的靶点之一。本文主要探究纳米级功能化氧化石墨烯(GO-PEI-PEG)携带PD-L1 siRNA对肝癌细胞
3、的恶性生物学行为的影响。研究结果显示,将GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA转染至MHCC97H细胞后,细胞的增殖和迁移均被抑制,细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡的数目增多。进一步研究发现,GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA对MHCC97H细胞的抑制作用是通过阻碍AKT信号通路激活实现的。这些试验结果表明,GO-PEI-PEG具备优秀的递送性能,携带PD-L1 siRNA可有效干扰PD-L1表达,进而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为,这为治疗HCC提供了更安全、有效的递送新策略。关键词:氧化石墨烯;PD-L1;siRNA递送;肝癌;AKT信号通路中图分类号:R735.7 文献标志
4、码:A DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.007Functionalized Graphene Oxide Carrying PD-L1 siRNA Inhibits the Malignant Biological Behaviors of Liver Cancer CellsLI Zhiweia,SHAN Lihonga,LIU Xirana,MIN Yanga,DING Xiaofenga,LI Liminb*(Hunan Normal University a.Gene Function&Regulation Laboratory,College
5、 of Life Science;b.College of Engineering and Design,Changsha 410081,China)Abstract:The programmed cell death protein 1(PD-1)/programmed cell death 1 ligand 1(PD-L1)signaling pathway is mainly involved in negative immune regulation and plays a crucial role in the malignant development of many types
6、of tumors.High expression of PD-L1 promotes HCC invasion and increases the risk of tumor recurrence.In addition,PD-L1 is often used as an immune checkpoint blockade target,mainly neutralized by monoclonal antibodies to trigger an anti-tumor immune re-sponse.Therefore,PD-L1 is one of the potential ta
7、rgets in HCC immunotherapy.This study mainly uses nano-scale function-alized graphene oxide(GO-PEI-PEG)to carry PD-L1 siRNA to explore the malignant biological effects on liver cancer cells.The results showed that after transfection of GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA into MHCC97H cells,the proliferation and
8、migration of cells were inhibited,the cell cycle was arrested in the G1 phase,and the number of apoptotic cells increased.It was further found that the inhibitory effect of GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA on MHCC97H cells was achieved by blocking the activation of the AKT signaling pathway.These experimental
9、 results show that GO-PEI-PEG has excellent delivery performance,carries 激光生物学报346第 32 卷肝癌(liver cancer)是全球第六大常见癌症和第四大致死癌症,目前中国原发肝癌新发病例为36.5万,死亡病例为31.9万1。肝癌因诊断发现时常为晚期,且治愈率低,对人类健康造成了严重的危害。根治性肝切除术仍然是肝细胞癌(hepatocel-lular carcinoma,HCC)的首要治疗手段,但是大约70%的患者在根治性治疗后存在复发的情况,导致5年生存率仅为40.0%71.9%2-3。除了传统治疗方式外,免疫
10、治疗也成为肝癌的治疗方法之一。免疫治疗是通过激发人体的免疫功能来发挥对肿瘤细胞的杀伤作用的4,主要分为过继免疫治疗和免疫检查点阻断治疗5。程序性死亡受体1(pro-grammed cell death protein 1,PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是常见的免疫检查点,它们主要在免疫调控中维持机体内的免疫平衡,起到免疫负调控作用。但是,在恶性肿瘤中,免疫负调控的功能被肿瘤细胞“利用”,使肿瘤细胞发生免疫逃逸6。研究表明,PD-L1的表达与许多类型肿瘤的恶性进展存在相关性,PD-L1的高表达可促进HCC的侵袭性增加,
11、提高根治性切除术后患者肝癌复发的风险7-9。另外,与原发性HCC相比,复发性的HCC表现出更高的PD-L1表达,导致复发性HCC细胞的逃避能力增强8。目前,以新型生物材料为载体携带核酸或化疗药物的靶向治疗被广泛研究及应用。常见递送核酸的载体分为病毒载体和非病毒载体10。病毒载体以其高转染效率和强稳定性备受关注,然而,它突变风险高且具有免疫原性,极易引发炎症,存在巨大的安全隐患9。非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子多聚复合物、多肽蛋白类递送载体以及多种基于阳离子高分子修饰的无机纳米颗粒11。这类载体不会引起机体免疫排斥反应,且具有灵活的修饰性12。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)
12、作为一种新型碳纳米材料,具有极佳的亲水性和生物相容性,并且经修饰和功能化后的衍生物常用于生物医学领域13。另外,在生物传感、成像、抗菌、免疫增强剂等领域中,GO也成为备受关注的对象14。本研究以PD-L1作为肝癌的治疗靶点,制备纳米级功能化氧化石墨烯(graphene oxide-polyethylen-imine-polyethyleneglycol,GO-PEI-PEG)作为PD-L1 siRNA的递送载体,在体外探究GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA对肝癌细胞的恶性生物学行为的影响。1材料与方法1.1材料细胞株:肝癌细胞系 MHCC97H(已通过STR鉴定)购自American
13、 Type Culture Collection(ATCC),于本实验室冻存。主要试剂:石墨粉末、H2SO4、KMnO4、30%过氧化氢均购于国药集团化学试剂有限公司;六臂胺端聚乙二醇(6-arm-PEG-NH2)购于上海芃硕生物科技有限公司(货号PS6-N-10K);25 kD支化聚乙烯亚胺(polyethylenimine,Branched)来自Sigma-Aldrich公司(货号9002-98-6)。胎牛血清(fetal bovine se-rum,FBS,货号FCS500)来自Excell bio公司,DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)培养基(货
14、号2252351)购自Vivacell公司,Opti-MEM培养基(货号31985070)购自Gibco公司,青霉素、链霉素(货号E607011-0100)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、氯化钠、甘氨酸、亚甲双丙烯酰胺、丙烯酰胺、考马斯亮蓝、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,E
15、DTA)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine,TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、蛋白抑制剂苯甲基磺酰氟(phenyl-methanesulfonyl fluoride,PMSF)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白Marker(货号PM901)购自北京金沙生物科技有限公司。细胞周期试剂盒(货号F10797)来自赛默飞世尔科技公司,细胞凋亡试剂盒(货号640914)来自Biolengd公司。NC PD
16、-L1 siRNA to effectively interfere with PD-L1 expression,and then inhibits the malignant biological behavior of liver cancer cells,which provides a safer and more effective delivery strategy for the treatment of HCC.Key words:graphene oxide;PD-L1;delivery of siRNA;liver cancer;AKT signaling pathway
17、(Acta Laser Biology Sinica,2023,32(4):345-352)347第 4 期siRNA、PD-L1 siRNA和PD-L1 siRNA-FAM购自上海吉玛制药技术有限公司;NC siRNA序列为sense:5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3;antisense:5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。PD-L1 siR-NA和PD-L1 siRNA-FAM序列均为sense:5-GUG-GCAUCCAAGAUACAAATT-3;antisense:5-UUU-GUAUCUUGGAUGCCACTT-3。抗体:-tubulin抗体(货号T
18、6199)购于Sigma公司,1:5 000稀释使用;BCl2抗体(货号sc-7382)购于Santa Cruz公司,1:1 000稀释使用;p-AKT(Ser473)(货号#9271)、p-CREB(货号#9198)和CREB抗体(货号#9197)购于Cell Signaling Technology公司,这两种抗体均1:1 000稀释使用;-catenin(货号66379-1-Ig)购于武汉三鹰生物技术有限公司,1:1 000稀释使用;PD-L1抗体(货号A1645)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司公司,1:500稀释使用;AKT抗体(货号D151600)购于生工生物工程(上海)股份有限公
19、司,1:600稀释使用;辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔(货号074-1506)、羊抗鼠(货号04-18-06)二抗为KPL品牌,1:5 000稀释使用。1.2 GO的制备GO的制备方法是根据传统的Hummers方法15进行改进的,简单步骤如下:在冰浴条件下,将70 mL H2SO4缓慢倒入圆底烧瓶中,缓慢搅拌。称取3.0 g石墨粉末少量多次倒入H2SO4中;待石墨粉末分散后,称取9.0 g KMnO4缓慢倒入体系中,此过程严格保证温度不高于20;待体系完全搅拌均匀后,转移至40的油浴锅中,剧烈搅拌30 min;随后,缓慢加入150 mL去离子水,升温至95,反应15 min;结束后,将体系倒入含0
20、.5 L去离子水的烧瓶中,并逐滴滴加15 mL 30%的双氧水。用去离子水离心洗涤产物至中性,用真空冷冻干燥仪对产物进行干燥。1.3GO-PEI-PEG的制备制备羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)的具体操作为:称取100 mg GO加入到10 mL去离子水中,超声得到分散液;往分散液中添加2.4 g NaOH和2.0 g C2H3ClO2,随后剧烈搅拌3 h;之后离心获得固体残余物,用去离子水充分洗涤至中性,即为GO-COOH。对GO-COOH进行功能化修饰:将 10 mg PEG和 10 mg EDC加入超声分散后的GO-COOH(0.5 mg/mL,20 mL)中;反应5 min后室温下搅
21、拌30 min;加入50 mL PEI(1 mg/mL)和15 mg EDC,超声处理5 min,然后室温下搅拌过夜;用去离子水洗涤反应产物至中性,获得GO-PEI-PEG溶液。1.4表征检测傅里叶红外光谱:将少量的GO、GO-COOH、GO-PEI和GO-PEI-PEG分别加入至干燥的溴化钾中,研磨均匀后,使用模具和压片机制备成溴化钾压片。放置于傅里叶红外光谱仪(NEXUS670)上检测样品光谱,波谱扫描范围为4004 000 cm-1。动态光散射(dynamic light scattering,DLS):首先,加1 mL去离子水至比色皿中,放入动态光散射仪(Nano ZS90)中扫描获取
22、背景数据;之后,按照同样参数分别对GO、GO-PEI和GO-PEI-PEG分散液(1 mL,0.1 mg/mL)进行扫描,获取Zeta电位。透射电子显微镜:将质量浓度为0.1 mg/mL的分散液(GO、GO-PEI和GO-PEI-PEG)滴加在铜网中,使用滤纸吸取多余的液体,过夜干燥。使用日本JEOL公司(JEOL2100)的透射电子显微镜拍摄样品的形貌图片。1.5细胞培养使用含 10%胎牛血清的DMEM培养基培养MHCC97H细胞,并放置在5%CO2、37培养箱中培养。1.6GO-PEI-PEG/siPD-L1转染试验按GO-PEI-PEG与siRNA的N/P为0.5配制混合物,具体操作如下
23、:在两管含有100 L Opti-MEM的RNase free离心管中分别加入5.0 L PD-L1 siRNA(20 mol/L)和7.5 L GO-PEI-PEG(0.1 mg/mL)进行稀释,室温条件下静置5 min。将两者混合均匀,室温条件下孵育30 min。PBS清洗细胞2次,加入1.8 mL不含血清的DMEM培养基,滴加转染混合物,置于37细胞培养箱中培养5 h,PBS清洗2次后,更换正常细胞培养基继续培养48 h。本文涉及的细胞表型试验和蛋白质免疫印迹试验的分组均为空白组(Blank组)、对照组(Control组)和PD-L1 siRNA组。Blank组仅添加GO-PEI-PEG
24、至细胞培养体系中;Control组将GO-PEI-PEG递送NC序列转染至细胞中;PD-L1 siRNA组将GO-PEI-PEG递送PD-L1 siRNA序列转染至细胞中。1.7Transwell迁移试验在24孔板中加入细胞培养基(每孔300 L),将Transwell小室(Corning,货号3413)放入孔板中,页眉文章标题李志伟等:功能化氧化石墨烯携带PD-L1 siRNA抑制肝癌细胞的恶性生物学行为李志伟等:功能化氧化石墨烯携带PD-L1 siRNA抑制肝癌细胞的恶性生物学行为激光生物学报348第 32 卷并添加100 L无血清培养基;接种转染处理后的MHCC97H细胞(1104个),
25、放置在37、5%CO2培养箱中培养24 h。之后,使用4%多聚甲醛固定,加入0.5%的结晶紫室温染色,使用显微镜获取图片,统计细胞总量。1.8克隆形成试验在6孔板中每孔加入500个转染后的细胞,加入2 mL完全培养基,放置于37、5%CO2的细胞培养箱中培养2周,每隔3天更换1次培养基。在显微镜下观察到有细胞团时,可使用多聚甲醛进行固定,用结晶紫染色。等干燥后,用数码相机拍照,并统计细胞数量。1.9细胞增殖检测以每孔5 000个的量将转染后的细胞接种于96孔板中。分别在第1、2、3天每孔加入100 L MTT,37继续培养4 h。使用酶标仪检测波长为 490 nm的吸光度。1.10细胞周期检测
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