高效液相色谱法测定甜梦胶囊中4种成分.pdf

食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 453收稿日期：2022-08-26作者简介：李志娇，主管中药师，从事药品检验及药品质量控制研究工作，E-mail:高效液相色谱法测定甜梦胶囊中4种成分李志娇1，巩长芹1，张晓博2，陈 静3，方君卉4，杨小薛1（1.临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001；2.齐鲁制药有限公司，山东 济南 250000；3.东阿阿胶健康连锁有限公司，山东 临沂 276001；4.枣庄市食品药品检验检测中心，山东 枣庄 277102）摘 要：目的 建立高效液相色谱-波长切换法同时测定甜梦胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、朝藿定C、橙皮苷的含量。方法 以Thermo Hypersil Gold AQ为色谱柱，选用乙腈（A）-0.2%甲酸（B）为流动相，梯度洗脱；毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测波长为260 nm，淫羊藿苷、朝藿定C检测波长为270 nm，橙皮苷检测波长为283 nm；流速为1.0 ml/min，柱温为30。结果 毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.04060.6893 g（r=0.9996）、橙皮苷进样量在0.06070.8415 g（r=0.9999）、朝藿定C进样量在0.03540.5415 g（r=0.9999）、淫羊藿苷进样量在0.02620.3939 g（r=0.9999）范围内有良好的线性关系；平均回收率分别为98.86%，98.29%，98.87%，99.12%，RSD均在2.0%以内。结论 此法准确、可靠、分离度高，重复性较好，可为甜梦胶囊的质量标准提供理论依据。关键词：甜梦胶囊；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；淫羊藿苷；朝藿定C；橙皮苷；高效液相色谱法中途分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）05-0453-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.015Simultaneous Determination of Four Components in Tianmeng Capsules by HPLCLI Zhi-jiao1,GONG Chang-qin1,ZHANG Xiao-bo2,CHEN Jing3,FANG Jun-hui4,YANG Xiao-xue1(1.Linyi Inspection and Testing Center,Linyi 276001,China;2.Qilu Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jinan 250000,China;3.Donge Ejiao Health Chain Co.,Ltd Linyi 276001,China;4.Zaozhuang Institute for Food and Drug Control,Zaozhuang 277102,China)Abstract:Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)-wavelength switching method for the simultaneous determination of calycosin glucoside,icariin,epimedin C and hesperidin in Tianmeng Capsules.Methods The chromatographic separation was carried out on a Thermo hypersil gold AQ,using acetonitrile(A)-0.2%formic acid(B)as the mobile phase of gradient elution.The UV detection wavelengths of calycosin glucoside,icariin,epimedin C and hesperidin were set at 260,270,270 and 283 nm.The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was set at 30.Results There was a good linear relationship in the range of 0.0406-0.6893 g(r=0.9996)for calycosin glucoside,0.0607-0.8415g(r=0.9999)for hesperidin,0.0354-0.5415 g(r=0.9999)for epimedium C and 0.0262-0.3939 g(r=0.9999)for icariin.The average recoveries were 98.86%,98.29%,98.87%and 99.12%,respectively,with RSDs less than 2.0%.Conclusion The method is accurate,reliable,with high separation and good repeatability,thus can provide theoretical basis for the quality standard of Tianmeng Capsules.Key Words:Tianmeng Capsules;calycosin glucoside;icariin;epimedin C;hesperidin;HPLC454 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期甜梦胶囊，是在奇效年良方枸杞丸基础上加味组方而成，主要成分有刺五加、淫羊藿、黄芪、陈皮、黄精、党参、枸杞子、黄花、山楂等，具益气补肾，健脾和胃，养心安神之功效，可改善心脾两虚患者失眠、多梦症状，缓解焦虑、抑郁情绪；临床上多用于头晕耳鸣，视减听衰，失眠健忘，食欲不振，腰膝酸软，心慌气短，卒中后遗症等症1-2。通过检索文献2-4，发现关于甜梦胶囊的特征性成分含量测定的报道较少，不能很好地监测药品的质量。本实验采用高效液相色谱-波长切换法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、朝藿定C以及橙皮苷4种特征性成分的含量，能更好地控制药品的质量。1 材料与仪器1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent 1260 Quat泵，DAD检测器，四元在线脱气机）；Thermo Hypersil Gold AQ（赛默飞世尔科技中国公司）色谱柱；XS205型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；Milli-Q超纯水机（法国默克）。1.2 药品与试剂毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201907，含量以96.8%计）、淫羊藿苷对照品（批号：110737-202017，含量以98.1%计）、朝藿定C对照品（批号：111780-201905，含量以94.3%计）、橙皮苷对照品（批号：110721-202019，含量以95.3%计）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（默克公司）；甲酸为色谱纯（阿拉丁）；水为超纯水；甜梦胶囊荣昌制药（淄博），批号：210107，210402，220207，211202）。2 方法2.1 色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil Gold AQ（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脱（020 min，A 15%30%；2030 min，A 30%35%；3040 min，A 35%40%）；流速为1.0 ml/min；检测波长：260 nm（012 min，检测毛蕊异黄酮苷）、283 nm（1218 min，检测橙皮苷）、270 nm（1840 min，检测淫羊藿苷、朝藿定C）；柱温为30；进样量为5 l。2.2 溶液制备2.2.1 对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品11.33 mg、淫羊藿苷对照品11.19 mg、朝藿定C对照品13.73 mg，橙皮苷对照品10.75 mg，分别置入50 ml棕色量瓶，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，备用。分别精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照储备液、淫羊藿苷对照储备液、朝藿定C对照储备液、橙皮苷对照储备液6.0，15.0，1.0，5.0 ml，置入同一50 ml棕色量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。2.2.2 供试品溶液制备 取甜梦胶囊内容物，混匀，研细，取5 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声提取30 min（功率300 W，频率40 kHz），放冷，用甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。2.2.3 阴性溶液制备 按甜梦胶囊的处方工艺，分别制备缺少黄芪、陈皮、淫羊藿的阴性样品，按供试品制备方法，制备成阴性溶液。2.3 专属性试验取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，按2.1项色谱条件进样分析。结果在供试品溶液色谱图中，呈现与混合对照品保留时间一致的特征峰，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷的保留时间分别为10.08，13.64，23.44，24.26 min，阴性溶液未呈现与照品保留时间一致的特征峰，表明阴性样品对所测组分没有干扰，各被测成分理论塔板数均大于15 000，各成分间的分离度均大于3.0，见图1。2.4 线性关系取2.2项下对照品溶液1，2，5，8，10，12，15 l，按2.1项下色谱条件进样分析，记录液相色谱图。以峰面积为纵坐标Y，进样量为横坐标X（g），计算回归方程。结果见表1。2.5 精密度取2.2项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件，食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 455连续进样6次，记录4种成分的峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积平均值分别为101.5，1067，321.9，306.6，RSD分别为0.32%，0.27%，0.67%，0.24%，表明仪器精密度较好。2.6 重复性分别精密称取同一批次（批号：220207）样品6份，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积平均值分别为97.88，1054，316.8，303.4，RSD为0.51%，0.46%，0.78%，0.60%，表明方法重复性良好。2.7 溶液稳定性取同一样品（批号：220207）溶液，放置室温中，分别在配制后0，4，6，8，10，12，24，36 h，进样分析，进样量为5 l，记录峰面积。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷面积的平均值分别为99.36，1065，321.5，310.2，RSD分别为1.02%，0.73%，1.04%，1.56%，表明供试品溶液36 h内比较稳定。2.8 加样回收取已知含量的同一批次（批号：220207）样品6份，每份约0.1 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，每份分别精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷对照品储备溶液1.0，5.0，5.0，6.0 ml，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，进样量为5 l，计算回收率。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均回收率为98.86%、橙皮苷平均回收率为98.29%、朝藿定C平均回收率为98.87%、淫羊藿苷平均回收率为99.12%，RSD均在2.0%以内。2.9 样品测定取4批甜梦胶囊（批号：210107，210402，220207，211202），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，进样量为5 l，记录峰面积，按外标法计算，结果见表2。表2 甜梦胶囊中4种成分含量测定结果/mgg-1（n=2）批号毛蕊异黄酮葡萄糖苷 橙皮苷 朝藿定C 淫羊藿苷21040220.74 302.89 177.98 129.73 21010721.95 290.67 174.49 124.84 22020723.78 318.22 184.82 133.84 21120221.24 306.89 180.98 132.49 3 讨论3.1 波长的选择对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷在190400 nm进行全波长扫描，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在260 nm、橙皮苷在283 nm、朝藿定C、淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收，因此选择260 nm作为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定波长、选择283 nm作为橙皮苷的测定波长、选择270 nm作为朝藿定C、淫羊藿苷测定波长。1：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2：橙皮苷；3：朝藿定C；4：淫羊藿苷A：混合对照品；B：甜梦胶囊样品溶液；C：缺黄芪的阴性溶液；D：缺陈皮的阴性溶液；E：缺淫羊藿的阴性溶液图1 甜梦胶囊中4种成分HPLC图表1 回归方程及其范围成分回归方程r线性范围毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=241.665X+1.598 0.9996 0.04060.6893橙皮苷Y=1641.190X+6.016 0.9999 0.06070.8415朝藿定CY=1650.339X+4.542 0.9999 0.03540.5415淫羊藿苷Y=1862.669X+1.917 0.9999 0.02620.3939456 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期3.2 流动相的选择参考中国药典2020年版一部中黄芪、淫羊藿及陈皮5和相关文献6-10，以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-水梯度洗脱，乙腈-水等度洗脱。通过试验，结果以乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，峰形好，4种成分分离度高，阴性样品干扰小。3.3 提取溶剂方法的选择参考文献2-10，试验中考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇作为提取溶剂，以及加入不同体积（20，25，50 ml）的提取溶剂。结果用25 ml甲醇作为提取溶剂，提取率最高；考察了超声20，30，45，60 min，及回流45，60 min的提取效果，结果表明，加入25 ml甲醇超声处理30，60 min与回流60 min，测得的结果相差很小，因此选择操作简单的超声方法作为该试验的提取方法，省时、简便。参考文献1 肖展翅,江燕丽.甜梦胶囊联合黛力新治疗慢性失眠症的疗效与安全性J.中西医结合心脑血管病杂志,2017,15(5):624-626.2 柯桂萍,程葵.高效液相色谱法测定甜梦胶囊中淫羊藿苷的含量J.医药导报,2009,28(1):107-108.3 葛德洲,邓祖磊.高效液相色谱蒸发光散射法测定甜梦胶囊中黄芪甲苷含量J.中国药业,2015,24(5):31-32.4 高秀丽,曹恒仪,王鹏娇.高效液相色谱法测定甜梦胶囊中淫羊藿苷的含量J.药物分析杂志,2007,27(12):1953-1955.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.2020年版一部.北京:中国医药科技出版社:199-200,315-316,340-341.6 陈莉,王盛,孟楣.HPLC法测定含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量J.中国药房,2018,29(15):2041-2045.7 李想,卢静华.HPLC 法同时测定加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷J.中成药,2015,37(9):1955-1958.8 承晨,李莉.HPLC法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量J.药学与临床研究,2020,28(4):263-265,269.9 宋青,郑晖,黄锦燕,等.HPLC同时测定和胃消痞丸中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的含量J.食品与药品,2021,23(5):425-428.10 徐文芬,杨雯,何顺志,等.一测多评法测定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A、B、CJ.药学与临床研究,2016,47(1):130-137.收稿日期：2022-06-08基金项目：北京中医药大学纵向发展基金（编号：2018-zxfzjj-002，81373780）作者简介：刘柘君，硕士研究生，研究方向：中西医结合药理学，E-mail:*通讯作者：孙文燕，博士，副教授，研究方向：中药药理学，E-mail:复方益生菌粉提高小鼠免疫力的实验研究刘柘君1，刘振权2，孙文燕2（1.北京中医药大学 中医学院，北京 100029；2.北京中医药大学 中药学院，北京 100029）摘 要：目的 探究鼠李糖乳杆菌R9639、干酪乳杆菌Zhang和植物乳杆菌P9三株益生菌组成的复方益生菌粉对小鼠免疫力的影响。方法 将小鼠分为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各10只，并分别灌胃给予同等纯净水，0.21，0.42，1.25 mg/(kgd)复方益生菌，观察复方益生菌对小鼠体重、脏器/体重比、溶血素半数溶血值、抗体生成细胞数量、迟发型变态反应、淋巴细胞转化、碳廓清功能、腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性的影响。结果 与阴性对照组比较，低、中、高剂量组小鼠体重、胸腺/体重比值和脾脏/体重比值差异均无统计学意义（P0.05）；高剂量组小鼠的迟发型变态反应程度显著增加（P0.01）；低、中、高剂量组小鼠的抗体生产细胞数量、溶血素半数溶血值、淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、碳廓清功能和腹腔巨噬细胞吞噬能力均显著增加（P0.01）。结论 复方益生菌粉能提高小鼠免疫力，结果符合保健食品检验与评价技术规范中“具有增强免疫力功能”的评价标准。关键词：益生菌；增强免疫力；体液免疫；细胞免疫；腹腔单核-巨噬细胞功能；NK细胞活性中图分类号：R96 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）05-0456-06DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.016