高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 0 8 0第4 2卷第6期2 0 2 3年1 1月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.6N o v.2 0 2 3高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响苏贵森1,2,李 敏1,陈 然1,胡高宇1,肖国强1,2,蔡景波1,张 翔1(1.浙江省海洋水产养殖研究所,浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室,温州市海洋生物遗传育种重点实验室,浙江 温州3 2 5 0 0 5;2.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海2 0 1 3 0 6)摘 要:为探明蟹公寓养殖模式下,高蛋白配合饲料替代杂鱼饲喂对拟穴青蟹菌群的影响,采用1 6 Sr R NA高通量测序技术,比较分析养殖过程中不同饵料组拟穴青蟹的肠道菌群结构。结果显示,各饵料组中优势菌群均为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门,占操作分类单元总数8 5.8 4%以上。不同饵料组共有细菌操作分类单元(6 9 5个)占总数的1 8.9 2%,其序列数占总序列数的9 5.3 9%。主坐标分析显示不同饵料组肠道菌群的群落结构未产生显著分化。共现性网络分析显示,随养殖过程推进,微生物互作网络复杂度降低。功能预测分析显示,细菌次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等功能主要在养殖前期出现显著性差异,而养殖后期饵料组间无显著性差异。试验结果表明,蟹公寓养殖过程中,不同饵料会对拟穴青蟹的肠道菌群造成影响。与杂鱼组相比,高蛋白配合饲料在维持肠道菌群多样性方面有一定优势,同时未显著影响肠道细菌群落结构和功能。关键词:蟹公寓;拟穴青蟹;饵料;肠道菌群;高通量测序中图分类号:S 9 6 3.7文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 6-0 9 5 5-1 1收稿日期:2 0 2 1-0 5-1 4;修回日期:2 0 2 2-0 5-1 3.基金项目:浙江省重点研发计划项目(2 0 1 9 C 0 2 0 4 5;2 0 1 8 C 0 2 0 3 9).作者简介:苏贵森(1 9 9 5),男,硕士研究生;研究方向:海水养殖.E-m a i l:1 0 3 1 2 1 7 9 5 6q q.c o m.通信作者:张翔(1 9 8 2),副研究员;研究方向:海水养殖与生态.E-m a i l:j h o n 6 1 81 6 3.c o m.拟穴青蟹(S c y l l ap a r a m a m o s a i n)简称青蟹,属甲壳纲十足目梭子蟹科青蟹属。2 0 1 9年养殖产量超过1 6万t,占海水养殖蟹类的一半以上1。目前,我国拟穴青蟹的养殖模式仍以池塘养殖为主,较为粗放,效率低;大量冰鲜饵料的投喂导致水域环境恶化,病害蔓延。近几年,也出现了吊笼养殖、蟹公寓等集约化、高密度的设施化养殖方式,但成本高、占比极低,未形成规模。设施化养殖可以实现环境因素可控,降低养殖风险,提高养殖效率,具有立体化、规模化、集约化的优点。因此,设施化养殖是拟穴青蟹绿色养殖的发展方向之一。肠道菌群是附着在肠道黏膜上的一个复杂多样的生态系统结构2,是由养殖动物、微生物及水环境三者相互作用而产生的有机整体,在肠道中保持着一种动态平衡。肠道菌群在维持宿主的生理活动、帮助宿主营养吸收及协助宿主免疫调节中具有重要作用3-5。水产动物肠道菌群的组成受很多因素的影响,包括水产动物的品种、水环境6-7、饵料8-1 1、药物1 2-1 3及水产动物的生理状态。其中,饵料在肠道菌群的塑造中起主导作用1 4,有研究表明,饵料中的蛋白源9、脂肪源1 5、糖源1 6等均会对养殖动物的肠道菌群结构产生影响。研究不同饵料对肠道微生物群落的影响,能发现饵料与肠道微生物的作用关系,对配合饲料的开发与应用具有重要意义。而目前蟹类养殖仍以冰鲜杂鱼投喂模式为主,杂鱼来源不稳定、质量不可控且对水质影响较大,因 此 配 合 饲 料 是 蟹 类 养 殖 发 展 的 重 要环节。有关拟穴青蟹肠道菌群的研究,多集中在传统池塘养殖模式下1 7-1 8,而“蟹公寓”养殖条件下的拟穴青蟹肠道菌群的研究较少。笔者在“蟹公寓”设施化条件下,通过高蛋白人工配合饲料与传统杂鱼进行饲喂,采用高通量测序技术比较分析不同饵料对拟穴青蟹肠道菌群的影响,为设施化条件下拟穴青蟹的肠道菌群的研究提供基础数据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物及养殖设施试验在浙江省海洋水产养殖研究所清江基地进行。组装2栋蟹公寓,每栋蟹公寓由6 0只蟹盒组成,1 0个蟹盒为一层,共6层。蟹盒尺寸为4 0c m3 0c m2 0c m,每个蟹盒养殖1只拟穴青蟹。每栋蟹公寓独立进出水,进水水质保持一致。拟穴青蟹采自浙江省乐清市清江镇,规格(5 2.94.9)g/只,于蟹公寓暂养7d。暂养期间,投喂鲜活低值贝类,水温(2 3.91.2),p H7.80.2,盐度2 2.10.5,溶解氧(7.80.3)m g/L。每日观察拟穴青蟹的摄食情况和活动情况。1.1.2 饵料制备试验 设置2种饵料:杂 鱼 鲢(H y p o p h t h a l-m i c h t h y sm o l i t r i x)、高蛋白配合饲料(健马牌幼鳗配合饲料),其主要营养成分见表1。表1 2种饵料的常规营养成分%T a b.1 N u t r i t i o n a l c o m p o s i t i o no f t w of e e d s分组G r o u p粗蛋白质C r u d ep r o t e i n粗灰分C r u d ea s h粗脂肪C r u d e f a t水分M o i s t u r e鲢1 9H.m o l i t r i x1 8.4 01.1 70.6 07 9.1 0高蛋白配合饲料E e l f e e d4 5.01 7.04.01 0.0试验所用杂鱼购自温州清江水产市场,带回实验室后,切成适宜规格。根据拟穴青蟹幼蟹的摄食特点,饲料应为粒径 3mm的沉性颗粒饲料。将高蛋白配合饲料加水和羧甲基纤维素钠,放入小型电动挤压颗粒机,制成高蛋白配合饲料颗粒,之后放入烘箱6 0 烘干至含水量小于1 0%,自然冷却后密封冷藏备用。1.2 试验方法1.2.1 试验设计及养殖管理选取规格相近、活力较好的拟穴青蟹1 2 0只(雄蟹6 0只,雌蟹6 0只),随机分成2组,记录体质量后,放入蟹公寓进行养殖。每日1 8:0 0前换水,清理残饵粪便;1 8:0 0,一组投喂鲢鱼肉,作为杂鱼组(3 0只雄蟹,3 0只雌蟹),另一组投喂鳗鱼饲料,作为高蛋白人工配合饲料组(3 0只雄蟹,3 0只雌蟹);2 1:3 0至翌日6:0 0,开启进水阀门,保持常流水,水流速0.2L/m i n;6:0 0至1 8:0 0静水养殖,减少拟穴青蟹的应激。试验于2 0 1 9年9月7日开始,养殖期共5 6d。各组进水水质条件一致,试验至第6周时,随季节变化水温逐渐降低,最低降至2 0.6,整个养殖期间,水温均在拟穴青蟹适宜范围内。每日1 8:0 0定时投喂1次,日投饲量为拟穴青蟹体质量8%1 0%。养殖期间,根据生长情况,每周调整1次投饲量,使投饲量接近饱食量,以略有残饵为准。养殖管理与暂养期间一致。1.2.2 样品收集与分析养殖至第4周时,每组随机选取1 2只拟穴青蟹 杂鱼4周组,高蛋白配合饲料4周组(简称“饲料4周组”),用灭菌的解剖器取其肠道并提取肠道细菌D N A。8周养殖试验结束后,每组随机选取1 0只拟穴青蟹 杂鱼8周组,高蛋白配合饲料8周组(简称“饲料8周组”),用灭菌解剖器取其肠道并提取肠道细菌D N A。采用下述方法提取细菌总D N A:在组织匀浆机(OMN I,B e a dR u p t o r 2 4)中对肠道组织进行匀浆,之后采用S t o o lD N AK i t(OM E G A)试剂盒提取肠道细菌总D N A。对1 6 Sr R N A基因V 3-V 4区进行P C R扩增,所 用引物序列 为:B 3 4 1 F(5-C C T A C G-G G N G G CWG C A G 3)和B 7 8 5 R(5-A C T A C HV G G-G T A T C T A A T C C-3),所得产物进行基于I l l u m i n aH i S e q测序平台的高通量测序。1.3 数据分析根据引物B a r c o d e序列,从原始测序数据中拆分出样品测序数据,使用F L A S H软件进行拼接,以9 7%的相似性对序列进行聚类,相似度大于9 7%的序列将聚为同一个运算分类单元,同时使用d e n o v o模式去除嵌合体序列,最终产生的运算分类单元代表序列将用于后续物种注释。采用S P S S2 2.0对试验数据进行统计分析,对不同饵料间采取t检验,取P饲料4周组(4 3 7.7 5)饲料8周组(3 8 7.5 5)杂鱼8周组(3 8 4.6 7),杂鱼组运算分类单元总数为2 4 4 3个,饲料组运算分类单元总数为2 2 6 7个,杂鱼4周组的平均运算分类单元数显著高于杂鱼8周组和饲料8周组(P 0.0 5)。659水 产 科 学第4 2卷表2 高通量测序结果分析 T a b.2 A n a l y s i s o f t h eh i g h-t h r o u g hs e q u e n c i n gr e s u l t s分组G r o u p原始序列数R a w-r e a d sn u m b e r优化序列数C l e a nr e a d sn u m b e r优化序列占比/%C l e a nr e a d s r a t e平均运算分类单元数A v e r a g en u m b e ro fO TU s覆盖率C o v e r a g e杂鱼4周组M i x e df i s h4-w e e kg r o u p8 72 3 6.9 21 87 6 8.3 36 66 0 5.8 31 53 1 2.5 97 6.1 21.6 75 5 1.7 52 0 2.5 20.9 9 4 60.0 0 1 8杂鱼8周组M i x e df i s h8-w e e kg r o u p6 97 8 8.3 380 7 1.8 55 17 0 3.0 070 5 8.4 57 3.9 62.0 63 8 4.6 71 8 9.4 20.9 9 6 50.0 0 1 8饲料4周组F e e d4-w e e kg r o u p7 34 0 5.8 387 0 1.3 45 47 7 7.7 567 6 8.4 57 4.5 90.9 54 3 7.7 51 4 5.4 60.9 9 6 20.0 0 1 4饲料8周组F e e d8-w e e kg r o u p7 14 1 6.0 09 4 8 0.4 55 34 0 8.2 268 3 2.0 57 4.8 41.5 93 8 7.5 51 2 5.0 10.9 9 6 70.0 0 1 12.2 肠道微生物多样性及其组成拟穴青蟹肠道菌群的多样性指数见图1,A c e指数和C h a o指数均代表物种丰富度,香农指数与辛普森指数均代表群落多样性。箱型图中的横线,从上到下依次为该组数据的上边缘、上四分位数、中位数、下四分位数及下边缘,超出上边缘或下边缘的数值为异常值。不同饵料组的肠道菌群在同一养殖阶段丰富度(A c e指数、C h a o指数)无显著差异,且随着养殖时间推移,肠道菌群丰富度呈降低趋势。香农指数随养殖时间的推移逐渐减小;辛普森指数杂鱼组随养殖时间的推移而增大,高蛋白配合饲料组随养殖时间的推移而减小,各组肠道微生物群落多样性无显著性差异(P0.0 5)。肠道微生物种群数量占2%以上的优势门类有4个(图2,表3),分别为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门。其中,变形菌门占比最大(5 4.0 7%6 2.8 5%),且在养殖过程中随时间逐渐增多;随养殖时间的推移,厚壁菌门占比逐渐减少。梭杆菌门在2个饵料组的变化趋势不同,高蛋白配合饲料组中,梭杆菌门随养殖时间的推移而逐渐减少,杂鱼组中梭杆菌门随养殖时间的推移而逐渐增多。拟杆菌门在2个饵料组的丰度表现出相反的变化趋势,高蛋白配合饲料组中,拟杆菌门随养殖时间的推移而逐渐增多,杂鱼组中拟杆菌门随养殖时间的推移而逐渐减少。显著性分析的结果表明,变形菌门、梭杆菌门在4组中的相对丰度无显著差异;厚壁菌门在饲料4周组中的相对丰度显著高于杂鱼组(P 0.0 5);拟杆菌门在杂鱼组中的相对丰度显著高于饲料4周组(P 0.0 5)。2种饵料的不同养殖阶段肠道微生物种群数量占1%以上的科有1 6个(图3,表4)。弧菌科是高蛋白配合饲料组与杂鱼8周组的第一优势菌,杂鱼4周组的第一优势菌为弯曲菌科。不同菌在养殖过程中的丰度变化趋势不同。在高蛋白配合饲料组中,弧菌科、梭杆菌科随养殖时间的推移而减少,杂鱼组中弧菌科、梭杆菌科随养殖时间的推移而增多。高蛋白配合饲料组中,弯曲菌科随养殖时间的推移而逐渐增多,杂鱼组中弯曲菌科随养殖时间的推移而逐渐减少。2个饵料组中消化链球菌科的相对丰度随养殖时间的推移而逐渐减少。弧菌科、梭杆菌科在4组中的相对丰度无显著性差异;弯曲菌科 在 杂 鱼4周 组 的 相 对 丰 度 显 著 高 于 饲 料4周组(P0.0 5)。基于w e i g h t e d-U n i f r a c距离的主坐标分析显示,在养殖前期,不同饵料组的肠道菌群分区明显,但随养殖时间的推移,不同饵料组之间的差异减小,菌群分区不明显(图4)。2.3 核心微生物类群组成2个饵料组拟穴青蟹肠道微生物的共有运算分类单元数为6 9 5个,占总运算分类单元数的1 8.9 2%,其序列数占总序列数的9 5.3 9%(图5)。其中,变形菌门占 优 势 地 位,占 核 心 微 生 物 总 相 对 丰 度 的5 9.9 6%,其次是梭杆菌门(1 2.0 2%)。弧菌科是变形菌门丰度最高的科(2 3.2 3%),其次是弯曲菌科(1 9.3 0%)。随着养殖时间的推移,2个饵料组拟穴青蟹肠道的特有运算分类单元数均呈降低趋势。饲料4周组特有运算分类单元占其总运算分类单元数的1 7.1 0%,饲料8周组特有运算分类单元占其总运算分类单元数的1 0.2 7%。饲料4周组特有运算分类单元中相对丰度最高的为厚壁菌门(4 8.9 0%),其次是变形菌门(2 8.1 1%)和拟杆菌门(1 4.9 4%);饲料8周组特有运算分类单元中相对丰度最高的为拟杆759第6期苏贵森等:高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响菌门(4 1.8 0%),其次是变形菌门(2 3.1 5%)和厚壁菌门(1 8.2 5%)。杂鱼4周组特有运算分类单元占其总运算分类单元数的2 2.3 5%,杂鱼8周组特有运算分类单元占其总运算分类单元数的8.5 1%。杂鱼4周组特有运算分类单元中相对丰度最高的为拟杆菌门(3 0.5 5%),其次是变形菌门(2 4.9 5%)和厚壁菌门(1 6.2 8%);杂鱼8周组特有运算分类单元中相对丰度最高的为变形菌门(5 1.7 8%),其次是厚壁菌门(2 3.1 9%)和拟杆菌门(6.9 7%)。图1 2种饵料条件下的拟穴青蟹肠道微生物的多样性指数F i g.1 T h ed i v e r s i t y i n d i c e s o f g u tm i c r o b i o t a i nm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i nf e dt h e t w ok i n d s o fd i e t s.注:标注相同小写字母或无字母表示差异不显著(P0.0 5),标注不同小写字母的平均值间差异显著(P0.0 5),w h i l em e a n sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r a r es i g n i f i c a n td i f f e r-e n c e(P0.0 5).M i x e df i s h4-w e e kg r o u p,f e e d4-w e e kg r o u p:n=1 2,m i x e d f i s h8-w e e kg r o u p,f e e d8-w e e kg r o u p:n=1 0,e t s e-q u e n t i a.表3 拟穴青蟹肠道微生物主要门类所占的平均比例%T a b.3 A v e r a g ep r o p o r t i o no fm a j o rp h y l u mi n i n t e s t i n a lm i c r o b i a l s a m p l e s f r o mm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i n分组G r o u p变形菌门P r o t e o b a c t e r i a厚壁菌门F i r m i c u t e s梭杆菌门F u s o b a c t e r i a拟杆菌门B a c t e r o i d e t e s合计T o t a l饲料4周组F e e d4-w e e kg r o u p5 4.0 72 3.6 6a1 4.8 31 0.4 1a1 6.3 91 4.6 1a3.3 52.8 3b8 8.6 4饲料8周组F e e d8-w e e kg r o u p5 8.1 81 4.9 6a8.1 16.2 7a b1 3.1 21 9.3 8a8.3 87.8 6a b8 7.7 9杂鱼4周组M i x e df i s h4-w e e kg r o u p6 1.4 41 8.0 8a7.2 94.3 5b6.7 38.2 0a9.1 47.8 3a8 4.6 0杂鱼8周组M i x e df i s h8-w e e kg r o u p6 2.8 52 3.9 2a6.4 07.6 1b1 0.4 39.3 2a6.1 61.8 4a8 5.8 4859水 产 科 学第4 2卷图2 拟穴青蟹肠道微生物样品在门水平上的物种组成F i g.2 P h y l u mc o m p o s i t i o ns t a c k i n gd i a g r a mo f i n t e s t i n a lm i c r o b i a l s a m p l e f r o mm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i n表4 拟穴青蟹肠道微生物主要科所占的平均比例%T a b.4 A v e r a g ep r o p o r t i o no fm a j o r f a m i l y i n i n t e s t i n a lm i c r o b i a l s a m p l e s f r o mm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i n科F a m i l y饲料4周组F e e d4-w e e kg r o u p饲料8周组F e e d8-w e e kg r o u p杂鱼4周组M i x e df i s h4-w e e kg r o u p杂鱼8周组M i x e df i s h8-w e e kg r o u p弧菌科V i b r i o n a c e a e2 8.0 62 3.2 2a2 1.9 91 4.7 7a1 3.6 51 1.6 9a3 4.6 23 0.6 2a弯曲菌科C a m p y l o b a c t e r a c e a e1 0.7 04.4 2b 2 0.4 31 5.7 2a b 2 8.1 82 0.6 6a 1 7.9 15.1 3a b 梭杆菌科F u s o b a c t e r i a c e a e1 6.3 66.2 5a 1 3.1 01.3 1a 6.7 14.5 3a 1 0.3 94.4 3a 总计T o t a l5 5.1 2 5 5.5 2 4 8.5 4 6 2.9 2 图3 拟穴青蟹肠道微生物优势科的相对丰度F i g.3 F a m i l yc o m p o s i t i o ns t a c k i n gd i a g r a mo f i n t e s t i n a lm i c r o b i a l s a m p l e f r o mm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i n959第6期苏贵森等:高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响图4 拟穴青蟹肠道细菌群落结构P C o A聚类分析F i g.4 P C o AC l u s t e ra n a l y s i s o f i n t e s t i n a l b a c t e r i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e i nm u dc r a b 图5 肠道细菌群落微生物运算分类单元个数的维恩图F i g.5 V e n nd i a g r a mo fO T Un u m b e r s i n i n t e s t i n a l b a c t e r i a l c o m m u n i t y养殖前期(4周),2种饵料组肠道共有运算分类单元序列数占二者总序列数的9 7.3 1%,二者共有序列数中相对丰度最高的为变形菌(5 8.8 4%),其次是梭杆菌门(1 1.7 7%)、厚壁菌门(1 0.5 8%)及拟杆菌门(5.4 2%)。养殖后期(8周),2种饵料组肠道共有 运 算 分 类 单 元 序 列 数 占 二 者 总 序 列 数 的9 8.7 8%,二者共有序列数中相对丰度最高的为变形菌门(6 0.7 0%),其次是梭杆菌门(1 1.9 0%)、厚壁菌门(7.2 6%)及拟杆菌门(7.0 0%)。2.4 肠道标志微生物及菌群共现关系利用线性判别分析筛选不同饵料组的拟穴青蟹肠道细菌主要判别类群(图6)。饲料4周组的标志微生物为消化链球菌科、弧菌科及M a r i n i f i l u m。饲料8周组的标志微生物为异常球菌纲、产碱菌科及瘤胃菌科。杂鱼4周组的标志微生物为衣原体门的衣原体属(C h l a m y d i i a)、短小盒菌科、布鲁氏菌科、红菌科、盐单胞菌科、G p 2 2科、微酸菌目、鱼立克次体科及脱硫弧菌目未分类菌。杂鱼8周组的标志微生物为芽孢杆菌科。不同饵料组拟穴青蟹肠道菌群的共现模式不同(图7)。饲料4周组、杂鱼4周组的共现性网络图呈现出较为单一的相关性。饲料4周组的共现网络中,弧菌科运算分类单元出现频率最高,红菌科、变形菌纲与弧菌科的相互作用关系在饲料4周组的共现网络中起重要作用。杂鱼4周组的共现网络中变形菌门的红菌科的运算分类单元出现频率最高且运算分类单元之间呈现较强的正相关性。随着养殖时间的推移,2个饵料组的肠道菌群的共现网络节点数呈降低趋势。饲料8周组的共现网络中,弧菌科出现频率最高且在共现网络中起重要作用。杂鱼8周组的共现网络中,弧菌科出现频率最高,但红菌科与其他菌群的联系最为密切。2.5 生物功能分析通过对本试验测得的1 6 Sr R N A序列比对C O G数据库,对拟穴青蟹肠道微生物的功能进行统计。通过统计注释到C O G第二等级代谢通路数量,发现不同饵料对拟穴青蟹肠道微生物功能的影响主要体现在细胞骨架及次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢(图8)。差异功能的显著性分析显示次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢中的醛/酮还原酶、八氢番茄红素脱氢相关蛋白、酯酶/脂肪酶、邻苯二酚-2,3-氧化酶、钙结合蛋白、聚(3-羟基丁酸酯)解聚酶及四氢嘧啶相关氧化酶,含植烷酰辅酶A双氧酶域等功能均为杂鱼4周组显著高于饲料4周组(P 0.0 5)。069水 产 科 学第4 2卷图6 拟穴青蟹肠道菌群的线性判别分析F i g.6 L i n e a rd i s c r i m i n a n t a n a l y s i s o fm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i n169第6期苏贵森等:高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响图7 不同饵料条件下拟穴青蟹肠道菌群的共现关系F i g.7 C o-o c c u r r e n c e r e l a t i o n s h i po f i n t e s t i n a l b a c t e r i a l c o m m u n i t i e s f o rm u dc r a bS.p a r a m a m o s a i nf e dw i t hd i f f e r e n t d i e t s.269水 产 科 学第4 2卷图8 不同饵料条件下拟穴青蟹肠道微生物C O G功能统计F i g.8 C O Gf u n c t i o nc a r t o g r a mo f g u tm i c r o b i o t a i nm u dc r a bS.P a r a m a m o s a i nf e dd i f f e r e n t d i e t s3 讨 论本试验采用蟹公寓立体养殖拟穴青蟹,生长数据显示,特定生长率和肝胰腺指数均为高蛋白配合饲料组略高于杂鱼组,2种饵料并未对拟穴青蟹的成活率、特定生长率及肝胰腺指数造成显著差异,笔者重点分析2种饵料对拟穴青蟹肠道群的影响。3.1 肠道微生物多样性及结构动物肠道菌群是一个复杂的微生态系统,是消化系统的重要组成部分,在水生动物的生长发育中起重要作用。卢德胤2 0的研究发现,中华绒螯蟹(E r i-o c h e i r s i n e n s i s)肠道内菌群组成与其饵料类型相互关联,进 而 影 响 蜕 壳 与 生 长。对 凡 纳 滨 对 虾(L i t o p e n a e u s v a n n a m e i)的研究也发现,肠道菌群与其健康生长息息相关2 1,因此研究肠道菌群对水生动物的健康养殖具有重要意义。L i等1 7运用P C R-D G G E对拟穴青蟹肠道细菌D N A的分析显示,柔膜菌门、变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、未分类细菌门和梭杆菌门为优势门类。王贤丰等1 8通过高通量测序技术分析了拟穴青蟹肠道及其池塘养殖环境的菌群结构,结果显示拟穴青蟹肠道的优势种类为变形菌门、柔膜菌门、厚壁菌门、C K C 4、拟杆菌门和梭杆菌门。本试验中拟穴青蟹肠道中优势细菌种类为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门及拟杆菌门,其中变形菌门占优势地位,说明变形菌门是拟穴青蟹肠道的重要细菌门类。有研究表明,变形菌门在不稳定肠道菌群中占比较高2 2-2 3,本试验中变形菌门相对丰度占比超5 0%且随养殖时间推移而增多,这表明2个饵料组的拟穴青蟹肠道可能均处于非稳定状态。本试验中,在养殖后期水温降低,拟穴青蟹的肠道细菌运算分类单元数减少,多样性也表现出降低趋势,与罗非鱼的研究结果相似2 4,说明养殖水温是影响拟穴青蟹肠道菌群的重要因素。养殖前期杂鱼4周组与饲料4周组的平均运算分类单元数无显著性差异,养殖后期杂鱼8周组与饲料8周组的平均运算分类单元数无显著差异;而随养殖时间的推移,杂鱼组的平均运算分类单元数显著降低(P 0.0 5),这说明高蛋白配合饲料在维持肠道菌群多样性方面有一定优势。本试验结果显示,高蛋白配合饲料组拟穴青蟹的弧菌科运算分类单元相对丰度由养殖前期(4周)的2 8.0 7%下降至养殖后期(8周)的2 1.9 9%;杂鱼组的弧菌科相对丰度在养殖后期(8周)升高至3 4.6 2%,而弧菌被认为是条件致病菌2 5,说明杂鱼组的拟穴青蟹在特定条件下,更易感染弧菌疾病。对其他水产动物的研究显示,饵料可以影响养殖动物的肠道菌群结构,但长期的菌群结构则与饵料、养殖水环境等多种因素有关,其中养殖水环境可能起到重要作用2 6。有研究表明,不同的养殖环境会影响鲢2 7、鳙(A r i s t i c h t h y sn o b i l i s)2 8的肠道菌群结构,说明养殖环境对养殖动物的肠道菌群结构的形成具有重要意义。与之前的研究结果相似,本试验中在养殖前期不同饵料组的拟穴青蟹肠道菌群结构表现出差异,但随养殖时间的推移,2种饵料组的肠道菌群结构的差异有减小趋势,这说明饵料可以在短期内影响拟穴青蟹的肠道菌群结构;养殖后期不同饵料组肠道菌群结构及多样性均呈现趋同现象,则可能与不同饵料组相似的养殖环境有关。3.2 核心微生物类群有研究表明,不同的养殖模式或环境可引起养殖369第6期苏贵森等:高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响动物肠道菌群结构的差异2 9-3 0,且不同饵料对养殖动物肠道核心菌群结构的影响不大3 1-3 2。本试验与之前的研究结果相似,随养殖时间的推移,2种饵料组的肠道共有微生物菌群呈上升趋势,主要表现为变形菌门的增加;不同饵料组的特有运算分类单元及其序列数的相对丰度,均随养殖时间的推移而降低,且主要门类均为变形菌门、厚壁菌门及拟杆菌门,可能是相同的养殖环境造成二者肠道微生物菌群的变化。饵料组分是影响肠道微生物组成的重要因素之一,不同饵料组拟穴青蟹独有运算分类单元的优势菌群不同,可能与肠道菌群对不同饵料的适应有关。3.3 共现模式及生物功能分析不同饵料组的肠道菌群共现模式不同。养殖前期肠道菌群的相互作用关系主要体现在科水平的菌群之间,弧菌科及红菌科在共现网络中起关键作用。养殖后期的相互作用关系主要体现在不同科的菌群之间,但共现网络中的节点数及节点之间的连接性降低,菌群之间的相关性复杂度降低,而菌群之间的节点数以及连接的传递性、模块化程度等均与肠道菌群的稳定性有关2 9-3 3,说明随着养殖时间的推移,拟穴青蟹肠道菌群的稳定性降低,可能导致拟穴青蟹较易感染细菌类疾病。不同饵料组拟穴青蟹肠道菌群的生物功能有所差异,但这种差异主要体现在养殖前期,C O G第二等级代谢通路下的次生代谢产物的生物合成,转运和分解代谢的差异体现在养殖前期,养殖后期2种饵料组之间无显著差异,与养殖时间中的共有O T U及菌群结构的变化趋势相吻合,说明在相似的养殖环境下,肠道菌群结构可能朝相近的方向发展。4 结 论本研究结果显示,不同饵料会对拟穴青蟹肠道微生物的菌群结构、多样性及生物功能产生影响,但随养殖时间的推移,2种饵料造成的差距有缩小趋势。高蛋白配合饲料组在维持肠道微生物多样性方面有一定优势,且具有来源稳定、质量可控及保存方便等优势,是一种较好的饵料选择。参考文献:1 农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.中国渔业统计年鉴-2 0 2 0M.北京:中国农业出版社,2 0 2 0:2 6-5 0.2 许燕,王印庚,张正,等.不同健康程度和抗生素氟苯尼考干预下斑石鲷肠道菌群的结构差异J.水产学报,2 0 1 8,4 2(3):3 8 8-3 9 8.3F L I N THJ,S C O T TKP,L O U I SP,e t a l.T h e r o l eo f t h eg u tm i c r o b i o t a i nn u t r i t i o na n dh e a l t hJ.N a t u r eR e v i e w sG a s t r o e n t e r o l o g y&H e p a t o l o g y,2 0 1 2,9(1 0):5 7 7-5 8 9.4MA N Z A N O M,I A C UM I NL,G I U S T OC,e ta l.U t i l i z a t i o no fd e n a t u r i n g g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s(D G G E)t oe v a l u a t et h ei n t e s t i n a lm i c r o b i o t ao fb r o w nt r o u tS a l m ot r u t t af a r i oJ.J o u r n a l o fV e t e r i n a r yS c i e n c e&M e d i c a lD i-a g n o s i s,2 0 1 2,1(2):1-6.5D ES CHR YV E RP,VA D S T E I N O.E c o l o g i c a lt h e o r ya sa f o u n d a t i o nt oc o n t r o lp a t h o g e n i c i n v a s i o ni na q u a-c u l t u r eJ.T h e I S MEJ o u r n a l,2 0 1 4,8(1 2):2 3 6 0-2 3 6 8.6B UR N SA R,S T E P HE N S W Z,S T AG AMAN K,e ta l.C o n t r i b u t i o no fn e u t r a l p r o c e s s e s t ot h ea s s e m b l yo fg u tm i c r o b i a lc o mm u n i t i e si nt h ez e b r a f i s ho v e rh o s td e v e l o p m e n tJ.T h eI S ME J o u r n a l,2 0 1 6,1 0(3):6 5 5-6 6 4.7WO N GS,R A WL SJF.I n t e s t i n a lm i c r o b i o t ac o m p o s i t i o ni n f i s h e s i s i n f l u e n c e db yh o s t e c o l o g y a n d e n v i r o n m e n tJ.M o l e c u l a rE c o l o g y,2 0 1 2,2 1(1 3):3 1 0 0-3 1 0 2.8 郝耀彤,吴山功,王桂堂,等.草鱼肠道微生物对食物改变适 应 性 变 化 的 研 究 J.淡 水 渔 业,2 0 1 5,4 5(3):4 6-5 1.9 张彦俊,石磊,谢天,等.大豆肽替代鱼粉对凡纳滨对虾肠道菌群的影响J.基因组学与应用生物学,2 0 2 0,3 9(1 1):5 0 8 4-5 0 9 0.1 0李秀玲,刘宝锁,刘波,等.不同脂肪源对卵形鲳鲹肠道微生物菌群的影响J.水产科学,2 0 2 0,3 9(1):8 8-9 5.1 1钟蕾,向建国,曾丹,等.饵料对鳡肠道微生物多样性的影响J.水生生物学报,2 0 1 6,4 0(4):8 3 0-8 3 5.1 2郭明凯.恩诺沙星和皮质醇对中华绒螯蟹(E r i o c h e i rs i n e n s i 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