高雄激素通过诱导细胞焦亡影响卵巢颗粒细胞增殖.pdf

生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期：13 9 9.DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.09.016高雄激素通过诱导细胞焦亡影响卵巢颗粒细胞增殖项雨1-2，丁慧敏1-2，陈田”，徐天月1-2，葛红山1-2*（1.南京中医药大学，南京2 10 0 2 3；2.泰州市人民医院，泰州2 2 530 0；3.张家港第一人民医院，张家港2 156 0 0）【摘要】目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)中高雄激素对卵巢颗粒细胞焦亡、增殖的影响。方法3周龄的ICR小鼠随机分为对照组（5只）和PCOS组（5只），PCOS组小鼠连续注射脱氢表雄酮（DHEA，6 m g/10 0 g 体重）2 1d，对照组小鼠则注射等体积不含DHEA的芝麻油。通过HE染色观察两组小鼠卵巢形态的变化；运用实时定量PCR和蛋白免疫印迹(WB)观察炎症及焦亡相关基因和蛋白在小鼠卵巢中的表达情况。通过睾酮（10 mol/L)诱导KGN细胞建立高雄诱导的PCOS体外细胞模型,对照组为不添加睾酮的培养基处理的KGN细胞，PCR法检测对照组和睾酮组细胞中炎症（NLRP3、NF-cB、I L-1)及焦亡（ASC、Ca s p a s e-1)相关基因的表达情况，运用WB和免疫荧光技术观察焦亡相关蛋白(Caspase-1、N-G SD M D/GSDMD)的表达情况，CCK8实验和LDH释放实验观察睾酮对KGN细胞生长的影响。结果HE染色显示PCOS组小鼠卵巢未成熟小卵泡及闭锁卵泡明显增多，提示PCOS模型构建成功。实时定量PCR结果显示，PCOS小鼠卵巢组织中NLRP3、NF-k B、I L-1、A SC 和Caspase-1的mRNA水平显著升高（P0.05）；WB的结果也显示炎症相关蛋白（NLRP3、IL-1、I L-18)和焦亡相关蛋白(Caspase-1、N-G SD M D/G SD M D)的水平显著高于对照组（P0.05）。在睾酮诱导的细胞模型中，睾酮组细胞观察到明显的焦亡征象，且炎症及焦亡相关基因表达均显著升高（P0.05)；睾酮处理后焦亡相关蛋白(Caspase-1、N-G SD M D/G SD M D)水平也显著高于对照组（P0.05）。另外，随着睾酮浓度的增加，KGN细胞存活率逐渐下降;LDH释放实验结果显示，睾酮处理后KGN细胞的活性降低，且在10 mol/L时LDH的释放量最大。结论高雄诱导的PCOS模型中存在异常的炎症激活和异常的焦亡，这可能是高雄激素影响卵巢颗粒细胞增殖生长的基础，为探讨高雄激素促进PCOS维持和发展的机制提供了新思路。【关键词】多囊卵巢综合征；高雄激素；慢性炎症；焦亡【中图分类号】R363Hyperandrogenism affects ovarian granulosa cell proliferation by inducing pyroptosisXIANG Yul-2,DING Hui-min12,CHEN Tian,XU Tian-yuel2,GE Hong-shanl-2-1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 2100232.TaizhouPeoples Hospital,Taizhou 2253003.Zhangjiagang Fist Peoples Hospital,Zhangjiagang【A b s t r a c t Objective:To investigate the effect of hyperandrogenism on pyroptosis and proliferation of ovariangranulosa in polycystic ovary syndrome(PCOS).Methods:The 3-week-old ICR mice were randomly divided into control(n=5)and PCOS groups(n=5).The mice in the PCOS group were continuously injected with DHEA(6 mg/100 g)for 21 days,whilethe mice in the control group were injected with the equal volume of sesame oil without DHEA.Themorphological changes of the ovaries in both groups were observed by hematoxylin-eosin staining(HE).The expression of genes and proteins related with inflammation(NLRP3,NF-KB,IL-1p)and pyroptosis(ASC,Caspase-1)in the two groups were detected by polymerase chain reaction(PCR).KGN cells wereinduced by testosterone(10 mol/L)to establish in vitro cell model of PCOS,while the KGN cells in the【收稿日期】2 0 2 3-0 2-18；【修回日期】2 0 2 3-0 4-0 2【作者简介】项雨，女，福建宁德人，硕士研究生，妇产科学专业，（*通讯作者）【文献标识码】Ag215600.1400control group were treated with culture medium without testosterone.The expression of the genes relatedwith inflammation(NLRP3,NF-kB,IL-1p)and pyroptosis(ASC,Caspase-1)in cells were detected by PCR,and the expression of proteins related with pyroptosis(Caspase-1,N-GSDMD/GSDMD)were detected byWestern blot.Finally,the effects of testosterone on growth of KGN cells were observed by the CCK8assay and LDH release assay.Results:HE staining showed that immature small follicles and atretic follicles significantly increasedin the ovary of mice in the PCOS group,suggesting that the PCOS model was successfully established.Real time quantitative PCR results showed that the mRNA levels of NLRP3,NF-B,IL-1,ASC andCaspase-1 significantly increased in in ovarian tissue of PCOS mice(P0.05).The Western blot resultsalso showed the proteins levels related with inflammation related proteins(NLRP3,IL-1,IL-18)andpyroptosis(Caspase-1,N-GSDMD/GSDMD)were significantly higher than those of the control group(P0.05).In the testosterone-induced cell model,obvious pyroptosis signs were observed in the testosteronegroup,and the expressions of inflammation and pyroptosis-related genes were significantly increased(PO.05).The levels of pyroptosis-related proteins after testosterone treatment was significantly higher thanthose in the control group(P0.05).In addition,the survival rate of KGN cells gradually decreased withthe increase of concentration of testosterone.The results of LDH release experiment showed that the activity ofKGN cells decreased after testosterone treatment,and the release of LDH was the highest at 10 mol/L.Conclusions:Abnormal inflammatory activation and abnormal pyroptosis were presented inhyperandrogenism-induced PCOS mice.It may be the basis of the effect of hyperandrogenism onproliferation and growth of ovarian granulosa cells.This study provides new ideas for exploring themechanism by which high androgen promotes the maintenance and development of PCOS.Key words:Polycystic ovary syndrome;Hyperandrogenism;Chronic inflammation;Pyroptosis(J Reprod Med 2023,32(09):1399-1406)多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性最常见素血症,影响类固醇生成和卵泡的闭锁，进而促进的一种内分泌和代谢紊乱的多因素疾病，约占无PCOS的维持11-12。最近有研究发现，过量的雄激排卵性不孕患者的8 0%2 。PCOS最主要的内分泌素可以通过激活炎症导致小鼠卵巢功能障碍和纤维特征是雄激素代谢异常，且高雄激素血症是PCOS化13-14。总之，慢性炎症在PCOS的发生发展中起诊断标准和共识的重要组成部分3。雄激素水平的重要作用15，是其发病机制的关键因素。异常升高可对卵泡发育产生负面影响，导致卵泡闭细胞焦亡是一种细胞内外稳态失调的炎症性的锁，损害卵母细胞成熟和胚胎发育4-5。环境中雄激细胞死亡，表现为与凋亡不同的染色质凝集，细胞肿素过高可干扰机体正常的内分泌功能，闭锁卵泡增胀膨大，以及细胞膜表面出现许多泡状突出物。它依加，类固醇激素合成减少，危害机体的生殖发育，导赖于特异性炎性 caspase的激活，导致Gasdermins家致其繁殖力明显下降6。针对恒河猴和绵羊的研究族蛋白发生剪切，其中主要是GSDMD裂解形成N表明，胎儿在宫内暴露的高雄激素环境与其青春期末端和C末端的结构域，活化的N末端在细胞膜上出现PCOS的临床表现密切相关，且会影响其早期定位成孔，导致细胞肿胀、质膜破裂进一步释放炎症卵巢的卵泡发育7-8 。介质IL-1和IL-18116。细胞焦亡的主要途径包括研究表明，高雄激素与炎症因子密切相关，高雄依赖于Caspase-1的经典途径和非Caspase-1依赖激素可以增加肿瘤坏死因子（TNF-）、NF-k B、I L-1、的非经典途径。细胞焦亡广泛存在于多细胞生物的IL-2、IL-6 和IL-17等炎症因子的水平9 ,而慢性炎各种组织中，当受到诱导因素刺激后，经信号转导系症也是PCOS的典型特征。越来越多的证据表明统的传递而激活焦亡。因此本研究拟通过构建高雄PCOS女性血清中炎症因子的浓度明显升高1.10 。PCOS动物模型及细胞模型，探究高雄激素对卵巢长期的慢性炎症会进一步加重胰岛素抵抗和高雄激颗粒细胞增殖的影响。生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期一、实验材料1.实验动物与分组：3周龄的ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK（苏)2 0 17-0 0 7。饲养于安静、光照明暗交替10 h/14h、温度2 0 2 5、湿度50%6 0%的环境中，自由饮水进食。适应性喂养1周后随机分为两组（对照组和PCOS组），每组5只。PCOS组每天注射脱氢表雄酮（DHEA，6 m g/100g体重，溶解在0.1ml芝麻油和0.0 1ml95%乙醇中），连续2 1d;对照组小鼠注射等体积不含DHEA的芝麻油。2 1d后取小鼠双侧卵巢，部分冻存于一8 0，部分固定于福尔马林中，用于后续处理。2.细胞系：人卵巢颗粒细胞系KGN细胞由中乔新舟生物科技有限公司提供。KGN细胞使用含有10%FBS(Sigma，美国）和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基（Gibco，美国）、置于37，5%CO,培养箱中培养。待细胞生长融合至8 0%时，睾酮组加入10 mol/L睾酮17（上海源叶）处理24h，同时对照组用未添加睾酮的培养基处理2 4h。二、研究方法1.卵巢组织HE染色：固定后的卵巢组织经脱基因名称种属ASChumanCaspase-1humanNLRP3humanNF-kBhumanIL-13human-actinhumanA.SCmouseCaspase-1mouseNLRP3mouseNF-kBmouseIL-1mouse-actinmouse3.蛋白免疫印迹（Westermblotting，WB）：提取小鼠卵巢组织和KGN细胞蛋白,BCA试剂盒（上海碧云天)测浓度后取2 0 g上样到12%的SDS凝胶进行电泳分离，后将蛋白转移至PVDF膜上。用:1401:水、包埋、切片、脱蜡、水化、苏木精和伊红染色后，显材料和方法微镜观察两组小鼠卵巢的形态学变化。2.RNA提取和实时定量PCR：将种植于6 孔板的 KGN细胞和卵巢组织分别与 Trizol(TIANGENG)混合。在每1mlTrizol中加人0.2 ml氯仿，旋涡摇匀15s，冰上孵育10 min后412 0 0 0 rpm离心15min。吸取上层水相于新的EP管中，加人等体积异丙醇混匀，冰上放置10 min后412 0 0 0 rpm离心10 min。弃上清，沉淀中加人1ml75%乙醇混匀后47 50 0 rpm离心5min。再次重复上述步骤,弃上清，室温风干515min。最后加入2 0 l焦碳酸二乙酯水（DEPC）重悬RNA。运用FastKinggDNA Dispelllng RT SuperMix(TIANGEN)将 RNA反转录为cDNA。实时定量PCR使用SuperReal荧光定量预混试剂增强版（TIANGEN)，按照说明书在Roche LightCycler 480 II Real-time qPCR System(Roche）上操作。阈值周期值（Ct)用于确定斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶酶-1（Caspase-1）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、NF-k B和IL-1的表达水平；然后，以-actin为内参，用公式2-Ct计算。将相对基因表达水平与对照组进行比较，所有实时定量PCR均做3个复孔。引物序列(5-3)ForwardGCGCTGGAGAACCTGACCGCCACACCGCCCAGAGCACAAGGATCTTCGCTGCGATCAACAGTGAACCGAAACTCTGGCAGCTGTTACAGTGGCAATGAGGATGACGTTGTCGACGACGAGCGGTCACAGAAGTGGACGGAGTGCGTGGAGAGAAACAAGGAGTGCCTGACCCAAACCCACCAGTAGCTTATGCCGAACTTCTCGCAGGCAGGCAGTATCACTCATTGGTGCTATGTTGCTCTAGACTTCGReverseCTCCTGCAGGCCCATGTCGCTCCCACAAATGCCTTCCCGAATACCGTGCATTATCTGAACCCCACCATCAGCTTGCGAAAAGGAGCCGTGGTGGTCGGAGATTCGTAGCACAGAGCCTCGCCTTCTCATCTTGTCTTGGCTGGTGAATGAAAAGTGAGCCCCTGACTTCTTTCGGATGAGGCTGCTTAGACTCCGGGATGGAATGTAACGTCACACACCAGCAGGTTATCATGCCACAGGATTCCATACC5%脱脂牛奶室温封闭2 h，T BST 清洗3次。将膜与抗NLRP3(1:1000)、I L-18(1:10 0 0)、I L-1(1：1 0 0 0)、G SD M D（1：1 0 0 0)、C a s p a s e-1(1：1 0 0 0)在4冰箱孵育过夜。第2 天用TBST1402清洗3遍，每次5min。之后将膜与二抗HRP GoatAnti-Rabbit IgG(1:500)或 HRP-conjugated AffinipureGoat Anti-Rat IgG（1：5 0 0 0）一起室温孵育 2 h。TBST清洗3遍后显影检测。ImageJ软件用于量化WB条带的强度。4.免疫荧光染色：按110 5细胞密度接种于12孔板的爬片上，待细胞生长融合至8 0%时，弃培养基，PBS清洗3遍。4%多聚甲醛固定15min后用PBS清洗3遍，然后再用0.5%TritonX-100（碧云天）冰上静置15min，PBS再次清洗3遍。封闭液封闭1h后，将细胞爬片与一抗（稀释度为1：2 0 0)一起在4冰箱中孵育过夜。第2 天用PBS清洗3遍后，将细胞爬片和二抗（稀释度为1：2 0 0)一起在湿盒中室温避光孵育1h。之后用PBS清洗3遍，并用DAPI避光孵育10 min。最后再次用PBS清洗3遍，用荧光淬灭剂封片后置于荧光显微镜下观察细胞。5.细胞活力测定：用CCK8试剂盒检测KGN的细胞活力。按110 4细胞密度接种于9 6 孔板，每孔10 0 l细胞悬液，置于37、5%CO,培养箱中培养。待细胞生长融合至8 0%时，对照组直接加入培养基,实验组加人分别含有1mol/L、10 mol/L、100mol/L睾酮的培养基，每组各做6 个复孔，在37、5%CO z 培养箱中培养2 4h后每孔加人10 l生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期CCK8溶液,继续在培养箱中培养30 min，之后用酶标仪测量450 nm的吸光度值。6.LDH释放实验：用LDH细胞毒性检测试剂盒(C0016,上海碧云天)来测定培养基中LDH的释放量。按1X104细胞密度接种于9 6 孔板中，待细胞生长融合至8 0%时，分别用不同浓度的睾酮（0、1、10、10 0 mol/L)处理2 4h，每组3个复孔。释放实验的步骤根据试剂盒的说明书进行。三、统计学分析采用GraphpadPrism9.0.0软件进行绘图和统计分析。计量资料以均值土标准差（士s)表示，组间比较采用独立样本t检验，多组比较运用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。结果一、PCOS小鼠模型卵巢形态学变化镜下观察对照组和PCOS组卵巢最大横截的形态、各级卵泡及黄体的变化，对照组可见不同时期的发育卵泡和排列整齐的颗粒细胞层（图1A);PCOS组卵巢内可见囊状扩张的卵泡，卵泡内颗粒细胞层减少，黄体数量减少，卵母细胞消失，未成熟小卵泡及闭锁卵泡明显增多（图2 A、表1）。另外，虽然给药前两组小鼠体重无显著差异，但给药后两组小鼠的体重及增重均发生显著改变（P0.05)（表2)。AA：对照组，黄色箭头示不同时期的发育卵泡；B:PCOS组，黑色箭头示囊状扩张的卵泡，红色箭头示未成熟小卵泡及闭锁卵泡。图1小鼠卵巢HE染色（X100)生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期表1两组小鼠卵巢组织中卵泡及黄体数量比较(士s)组别切片数对照组5PCOS 组5注：与对照组比较，*P0.01,*P0.001,*P0.0001。组别给药前体重/g对照组5PCOS 组5注：与对照组比较，*P0.05，*P 0.0 1。二、PCOS小鼠卵巢组织中炎症及焦亡相关基因和蛋白的表达情况为了确定PCOS小鼠卵巢是否存在炎症及异常焦亡的激活,分别检测了对照组和PCOS 组小鼠卵巢组织中炎症及焦亡相关基因和蛋白的表达。GSDMD为焦亡通路的关键蛋白，其被激活后裂解为GSDMD-N起作用，故此次WB统计分析时用N-GSDMD/GSDMD代表焦亡水平。PCR结果显示,PCOS小鼠卵巢组织中 NLRP3、NF-K B、IL-1、A SC 和 Caspase-1的mRNA水平显著升高（P0.05)（图2）。WB的结1403总卵泡生长卵泡34.004.3020.602.0742.203.11*12.001.41*表2 两组小鼠给药前后的体重变化（元士s)例数13.961.0214.001.07闭锁卵泡和小卵泡13.403.2128.203.63*给药后体重/g20.001.4522.880.79*显著高于对照组（P0.05)（图3）。2.01.5*H1.00.5F0NLRP3囊状卵泡00226.041.498.881.19*IL-1黄体4.801.791.401.34*增重/g1对照组PCOS组工Caspase-1对照组果也表明炎症相关蛋白（NLRP3、I L-1、I L-18）和焦亡相关蛋白(Caspase-1、N-G SD M D/G SD M D)的水平*-actin1Caspase-1GSDMDN-GSDMD注：与对照组比较，P0.05,*P0.01。图2 两组小鼠卵巢组织中炎症及焦亡相关基因的PCR结果对照组PCOS组NLRP3IL-1-actinIL-18320*PCOS组*工*Caspase-1N-GSDMD/-actin注：GSDMD-N/GSDMD代表焦亡水平；与对照组比较，P0.05，*P 0.0 1，*P 0.0 0 1。图3两组小鼠卵巢组织中炎症及焦亡相关蛋白WB结果1404三、不同KCN细胞组的细胞炎症和焦亡的相关基因及蛋白的表达为了进一步确定高浓度的雄激素对卵巢颗粒细胞的影响，使用睾酮（10 mol/L）处理KGN细胞后，分别观察睾酮组和对照组细胞形态的变化并研究在高雄激素环境中颗粒细胞炎症及焦亡相关基因和蛋白的变化。对照组KGN细胞呈成纤维样或梭生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期形并向周围伸出伪足；睾酮给药处理后的细胞逐渐肿胀变圆，出现明显的焦亡征象即细胞膜表面出现许多的突出小泡（图4)。与对照组相比，睾酮组中NLRP3、NF-K B、IL-1、A SC 和 Caspase-1 的 mRNA水平显著升高（图5）。WB及免疫荧光的结果显示，焦亡相关蛋白Caspase-1及N-GSDMD/GSDMD在睾酮组中的水平显著高于对照组（图6 图7)。A:对照组;B:睾酮(10 mol/L)组图4两组KGN细胞的形态学比较（X200)2.52.01.51.00.50NLRP3四、睾酮对KGN细胞活力及增殖的影响*NF-KB*对照组睾酮组为了研究在高雄激素环境中卵巢颗粒细胞生长是否受损，我们首先通过体外实验检测不同浓度的睾酮对细胞活力的影响。分别用1 mol/L、10 mol/L和10 0 mol/L的睾酮处理KGN细胞24h后用CCK8检测细胞增殖，结果表明，随着睾酮浓度的增加细胞存活率逐渐下降（图8）。之后我们通过LDH释放实验来检测细胞活性，通过吸光注：与对照组比较，P0.05，P 0.0 1,*P 0.0 0 1,*P 0.0 0 0 1。图5两组KGN细胞中炎症及焦亡相关基因的PCR结果2.0对照组睾酮组Caspase-1GSDMDN-GSDMD-actinCaspase-1度测定发现睾酮处理后细胞的活性降低，且在10mol/L时LDH的释放量最大（图9)。*1.51.00.50Caspase-1对照组口睾酮组GSDMD注：GSDMD-N/GSDMD代表焦亡水平；与对照组比较，*P0.01。图6 两组KGN细胞中焦亡相关蛋白的WB结果生殖医学杂志2 0 2 3年9 月第32 卷第9 期:1405.对照组睾酮组对照组IdV睾酮组图7 两组KGN细胞中焦亡相关蛋白的表达（免疫荧光10 0 010080(%）/6040200图8 不同浓度睾酮处理2 4h后KGN细胞的存活率108(%)/HAT6420图不同浓度睾酮处理KGN细胞后LDH的释放讨论PCOS是育龄期妇女出现生殖功能障碍最常见的原因,多存在卵巢功能受损，卵泡发育及类固醇的生成异常18 。而高雄激素血症是PCOS最主要的内分泌特征之一，不仅是PCOS重要的临床表现，还是其主要的病因19 。目前许多研究已经证实，高雄激素与PCOS代谢紊乱及卵巢功能障碍密切相关，但其具体机制尚未完全明确。研究表明，体内的高雄激素环境可增加促炎因子的水平，而炎症的异常累积会损害卵巢功能，进一步促进PCOS的发生发展2 0 。越来越多的证据表明，慢性低度的炎症状态是PCOS长期持续的重要对照组1 mol/L对照组1 mol/L注：与对照组比较，*P0.01。10 mol/L睾酮*10 mol/L睾酮100 mol/L100 mol/L因素1。本研究也表明,在高雄激素诱导的PCOS小鼠模型中炎症相关基因（NLRP3、NF-K B、IL-1)和蛋白（NLRP3、I L-1、I L-18)的表达水平均显著升高,且 Caspase-1及N-GSDMD/GSDMD的表达水平也较对照组增加。因此我们推测高雄激素在促进PCOS炎症激活的同时也诱导了焦亡的发生。在我国，卵泡功能障碍是导致PCOS不孕的主要原因2 1，且卵巢颗粒细胞在卵泡发育过程中起着至关重要的作用。为了进一步确定高雄激素对炎症及焦亡的影响，我们用睾酮处理KGN细胞来模拟PCOS患者体内的高雄激素状态。细胞焦亡是一种炎症性的细胞死亡，过度的炎症激活可促进细胞焦亡的发生2 2 。在睾酮的刺激下,炎症相关基因水平均显著升高。光镜下观察到睾酮组细胞形态也发生了明显变化，失去原有细胞形态逐渐肿胀变圆，细胞膜表面出现许多突出小泡，为焦亡的典型特征。此外，睾酮也增加了KGN细胞中 Caspase-1 和N-GSDMD/GSDMD的表达水平。这些数据表明，睾酮促进卵巢颗粒细胞炎症及焦亡的异常激活。我们还发现随1406：着睾酮浓度的增加,卵巢颗粒细胞的增殖也受到影响，因此我们推测高雄激素可通过诱导焦亡来影响卵巢颗粒细胞增殖，进而影响卵泡及卵母细胞的质量，最终导致不孕。目前PCOS的发病机制尚未完全明确，而焦亡可能在PCOS的发生发展中起作用2 31。根据我们的研究，高雄激素可以激活慢性炎症，从而诱发卵巢颗粒细胞焦亡，影响其增殖，有助于为PCOS的治疗提供新思路。后续还需进一步研究高雄调控细胞焦亡，影响PCOS卵巢功能和生殖能力的可能机制。本实验仅发现了PCOS模型小鼠卵巢组织中炎症及焦亡相关蛋白水平的异常，未进一步研究PCOS小鼠卵巢颗粒细胞中相关基因及蛋白的变化情况，此为本实验的不足之处，后续将进一步研究PCOS小鼠模型卵巢颗粒细胞中焦亡及炎症的变化情况。【参考文献】1 AbrahamGnanadass S,Divakar Prabhu Y,Valsala GopalakrishnanA.Association of metabolic and inflammatory markers withpolycystic ovarian syndrome(PCOS):an update JJ.ArchGynecol Obstet,2021,303:631-643.2 Balen AH,Morley LC,Misso M,et al.The management ofanovulatory infertility in women with polycystic ovarysyndrome:an analysis of the evidence to support thedevelopment of global WHO guidanceJ.Hum ReprodUpdate,2016,22:687-708.3Meier RK.Polycystic ovary syndromeJJ.Nurs Clin NorthAm,2018,53:407-420.4De 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