高原低氧环境下HDAC5在大鼠体内P-gp表达中的作用及对苯妥英钠药代影响.pdf

网络出版时间：网络出版地址：药物代谢动力学高原低氧环境下 在大鼠体内 表达中的作用及对苯妥英钠药代影响赵以览，牟宏芳，张晓静，罗林，封士兰，贺嘉馨，赵安鹏，王荣，（中国人民解放军联勤保障部队第九四医院药剂科，甘肃 兰州 ；兰州大学药学院，甘肃 兰州 ；甘肃省高原药学行业技术中心，甘肃 兰州 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：甘肃省青年科技基金计划（）作者简介：赵以览（），女，硕士生，研究方向：高原药代动力学，：；王荣（），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：药理学，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中 国 图 书 分 类 号：；摘要：目的探究高原低氧环境下 在大鼠体内 表达中的关键作用及对苯妥英钠药代的影响。方法 大鼠运至海拔 的青海玉树巴塘，每组 只。不同组分别给予苯妥英钠、苯妥英钠联用金丝桃素、苯妥英钠联用维拉帕米。在高原地区收集服药后不同时间的血浆和肝组织。采用 法测定血浆中苯妥英钠的浓度，计算药代动力学参数。检测肝组织中 、蛋白表达的变化。结果 结果表明，给予 激动剂后，（）、（）、（）、（）、增 加；给 予 抑 制 剂 后，（）、（）、（）、（）、降低。同时，高原低氧环境下，参与 表达的调控。当给予 激动剂和抑制剂时，与 表达呈现相同变化趋势。结论高原低氧环境下，肝中转运体 的表达影响了 底物苯妥英钠的药代动力学，的变化水平与 有关。关键词：高原低氧；苯妥英钠；表观遗传学；药代动力学开放科学（资源服务）标识码（）：高原环境复杂多样，有着低氧、低气压、高紫外线等特点，其中低氧是其最显著的特点。糖蛋白（，）也被称为多药耐药蛋白（，）、（），是广泛分布的转运体。在肝中含量较高，对于药物的排出具有重要作用。苯妥英钠是治疗癫痫大发作的首选药物，其治疗窗较窄、安全性较低；同时也是 的底物，经由肝脏代谢，经过肠肝循环，因此对苯妥英钠进行药物浓度监测具有重要的临床意义。前期研究表明，高原低氧环境引起苯妥英钠药代动力学参数的改变，且这种改变与 密切相关 。可受到众多的激动剂和抑制剂的调控，金丝桃素作为 激动剂 ，维拉帕米作为 抑制剂 ，二者对 表达均具有调控作用，从而影响 底物的药代动力学。给予金丝桃素和维拉帕米，可以使 表达水平发生改变。表观遗传学是近年来的研究热点，可能对转运体的表达产生一定的调控作用，针对组蛋白乙酰化的研究是其中的重要内容。组蛋白去乙酰化酶（，）家族分为 大类，类、类、类和 类。类为 、；类 为 、；类 为 、；类 为 家 族；类 为 。（）作为类 ，是关键的转录调控物质，它可穿梭于细胞核与细胞质之间，从而对蛋白的表达产生一系列作用 ；作为新兴的治疗靶点 ，得到了广泛的关注。课题组前期研究发现，低氧条件下的大鼠肝细胞中和急进高原的大鼠的肝脏中，的表达升高，表达下降，且 对 存在调控作用。但在高原低氧环境下，与 的关联尚不明确。此研究首次提出，高原低氧条件下，组蛋白乙酰化酶 对转运体 的调控作用影响了 底物的药代动力学。材料与方法 药品与试剂 甲醇（，）、乙腈（，）、甲酸（，）、灭菌注射用水（四川科伦药业有限公司）、苯妥英钠（云鹏医药，规格：片）、金丝桃素（江苏永健医药，中国药理学通报 ；（）：）、维拉帕米（天津市中央药业，规格：片）、苯妥英钠（，源叶生物）、氯雷他定（，麦克林）。引物由上海生工设计并合成。（）、（，）、（，）、（索莱宝）、（索莱宝）、（索莱宝）、膜蛋白提取试剂盒（）、试剂盒（索莱宝）、抗体（）、抗体（）、抗体（）、抗 体（）、抗 体（）、抗体（）、（索莱宝）、膜（）、脱脂奶粉（索莱宝）、兔抗（）。仪器 高效液相色谱仪（日本岛津公司）、三重四级杆串联质谱仪（）、型 冷 冻 离 心 机（）、型万分之一电子天平（梅特勒 托利多有限公司）、离心浓缩仪（德国 公司）、低温高速离心机（美国 公司、工作台（西班牙 ）、匀浆机（瑞士 ）、酶标仪（）、紫外分光光度计（上海天美）、实时定量荧光 仪（美国 ）、电泳仪（）、曝光仪（）。实验动物 级健康 ，雄鼠，体质量（），动物许可证号：（京），北京斯贝福生物技术有限公司。获联勤保障部队第九四医院伦理委员会审批通过，。方法 实验动物分组 大鼠作如下随机分组，每组 只：高原给苯妥英钠药代组（）、高原给苯妥英钠和金丝桃素药代组（）、高原给苯妥英钠和维拉帕米药代组（）、高原给苯妥英钠组第一天组（）、高原给苯妥英钠和金丝桃素第一天组（）、高原给苯妥英钠和维拉帕米第一天组（）。药代动力学实验各组大鼠禁食 后，分别每组给予苯妥英钠、苯妥英钠和金丝桃素、苯妥英钠和维拉帕米灌胃。在给药 、从大鼠眼眶后静脉丛取血 ，迅速收集于事先用肝素润湿的离心管中，离心 ，取上清液于 冰箱中保存备用。样品采集人道主义处死大鼠，取其肝组织，保存于 。液相色谱 串联质谱条件液相色谱的条件如下：色谱柱：（，），柱温为 。等度洗脱流动相配比为乙腈 水 甲酸（，）。流动相的流速为 。每个样品的进样量为 ，分析时间为 。质谱的条件条件如下：采用负离子多反应模式、电喷雾离子源进行检测，喷雾电压为 ，雾化温度为 。苯妥英钠、氯雷他定的碰撞能量分别为 、；碰撞诱导解离电压分别为 、。苯妥英钠、氯雷他定的检测离子分别为 、。标准曲线及质控样品的制备分别精密称取 苯妥英钠和氯雷他定对照品，用甲醇定容于 容量瓶中，配成浓度均为 的标准储备液。用大鼠空白血浆将苯妥英钠储备液依次稀释 为 、的含药血浆样品，即为苯妥英钠的标准曲线溶液。用空白血浆配置苯妥英钠浓度为 、的低、中、高质控样品。用甲醇溶解、乙腈稀释称取的氯雷他定标准品，得到浓度为 的氯雷他定乙腈内标溶液。血浆样品预处理取大鼠血浆 于 离心管内，加入乙腈 ，涡旋震荡 。离心 ，取其上清至新的 离心管中。随后放入离心浓缩仪，挥干有机相后加入内标溶液 复溶，涡旋振荡 ，、离心 ，吸上清 进样分析。于冰上解冻组织并称取 。分别用膜蛋白提取试剂盒和 提取膜蛋白和总蛋白，并加入 ，蛋白定量后加入 。用 检测 （）、（）、（）、（）、（）、（）的表达。统计学处理应用 进行统计学分析，用 作图。两组组间比较采用 检验；多组间比较采用 分析，两两比较用 检验。结果 方法学验证 专属性取空白血浆、空白血浆配制的苯妥中国药理学通报 ；（）：，：，：，：，：英钠对照品溶液及给药后采集的大鼠血浆样品，按“”项方法处理并分析，色谱图如 所示，样品中未见苯妥英钠及其内标物质的干扰峰，表明该方法专属性良好。线性范围及定量下限通过“”项方法处理苯妥英钠标准含药血浆样品。标准曲线方程为：（）。结果表明，苯妥英钠血浆浓度在 范围内线性关系良好，定量下限为 。精密度和准确度按“”项制备含苯妥英钠的 、的质控样品，经“”项血样预处理后进行分析。选择 内的 个不同时间点及连续 在相同时间点进行样品测定，以考察样品日内与日间的精密度与准确度，每个样品测定 次。结果如 所示，本方法的日间、日内精密度 在 ，准确度在 ，符合生物样本分析要求。（珋 ，）稳定性以 放置 、反复冻融次、室温放置 考察样品的稳定性。按“”项方法处理并分析，苯妥英钠的 均小于 ，该方法的血浆样品稳定性良好，见 。基质效应和提取回收率用大鼠空白血浆制备含苯妥英钠 、的质控样品，分析获得苯妥英钠峰面积的平均值 ；同时用乙腈配制相同质量浓度的对照品溶液，加入内标溶液，测得苯妥英钠面积的平均值 。基质效应 。通过对比苯妥英钠和氯雷他定的响应值，判断是否对其测定产生干扰，见 。用大鼠空白血浆配制 、的 个质量浓度空白血浆苯妥英钠对照品溶液，加入内标溶液，样品前处理后，测得苯妥英钠的峰面积为 ；另取大鼠空白血浆，前处理后配制相同质量浓度的空白血浆苯妥英钠样品，加入内标溶液，测定苯妥英钠的峰面积为 ，见 。（珋 ，）（珋 ，）不同组别的苯妥英钠药代参数课题组前期研究发现，平原组大鼠和高原组大鼠分别给予相同剂量的苯妥英钠后，高原组大鼠的 明显上升，明显下降 ，作为 底物的苯妥英钠的代谢与排泄与肝肾上 的表达水平密切相关。本实验中，高原低氧环境下不同组别的苯妥英钠药代动力学曲线如 所示，药代参数如 所示。与仅给予苯妥英钠组相比，苯妥英钠合用金丝桃素组大鼠 （）增加了 ，（）增加了 ，（）增加了 ，（）增加了 ，增加了 ，增加了 ，增加了 。表明在高原缺氧条件下，（）、（）、（）、（）、增加。金丝桃素作为 激动剂使 中国药理学通报 ；（）（珋 ，）（）（）（）（），（）表达升高，影响了苯妥英钠的药代动力学参数，使苯妥英钠吸收减少。与仅给予苯妥英钠组相比，苯妥英钠合用维拉帕米组大鼠 （）降低了 ，（）降低了 ，（）降低了 ，（）降低了 ，降低了 ，升高了 ，降低了 。表明在高原缺氧条件下，给予 抑制剂使大鼠体内 表达减少，（）、（）、（）、（）、降低，基本持平。维拉帕米作为 抑制剂剂使 表达降低，影响了苯妥英钠的药代动力学参数，使苯妥英钠的吸收增加。高原低氧环境下大鼠肝组织中转运体变化较大，且这种变化与表观遗传学有关 。因此，在高原低氧条件下，表观遗传学可能影响了肝中转运体 的表达，从而影响了 底物苯妥英钠的药代动力学。不同组别的肝 表达水平相较于 组，组 表达上升，组 表达下降，见 。金丝桃素和维拉帕米作为激动剂和抑制剂都起到了良好的作用。不同组别肝脏中 的表达水平相较于 组，组 蛋白水平下降，组 蛋白水平上升，见 。（珋 ，）（珋 ，）中国药理学通报 ；（）讨论在高原低氧环境下，相较于平原常氧，大鼠肝脏中 的表达与 密切相关。当给予 激动剂或抑制剂时，表达发生相应的变化，同时 的变化中伴随着 的变化。研究结果说明，在高原低氧环境下，调控了大鼠肝脏中 的表达，这种调控作用影响了 底物的药代动力学。然而，和 之间的具体调控关系，是否直接或间接地调控，是否中间存在其它因素的参与，仍需要进一步探索。具有高度保守的 端去乙酰化酶催化结构域，并共享 端结构域。可以进行核质穿梭，并在入核后与启动子结合时抑制蛋白的转录，因此可能成为潜在的治疗靶点。具有调控蛋白表达的作用，当它与基因序列结合时，基因转录受到抑制；而当其离开时，则该基因可以顺利转录 。在蛋白表达中的作用，促使它可成为有效的调控靶点。表观遗传修饰包括许多过程，参与了转运体从基因到表达的许多阶段，可以影响转运体的表达和功能，从而对药物的吸收、分布、排泄以及代谢产生作用。梁萌等 发现，通过健康志愿者进入高原前后的不同时间点的转录组和 甲基化数据，得到个甲基化位点的甲基化水平均有变化。等 推测高海拔地区的先兆子痫患者的后代中，甲基化和组蛋白去乙酰化酶抑制剂可能与肺血管功能障碍和先兆子痫有关。刘洁 通过甲基化芯片在世居高海拔藏族居民和移居低海拔藏族居民之中发现了 个差异甲基化位点，且有几个差异甲基化基因。等 通过从急性暴露于海拔 的个体中获得样本，发现十二指肠中顶端膜钠离子依赖型胆汁酸转运体、浓缩核苷转运蛋白 、大鼠有机阴离子转运肽、肉碱转运体、肠道肽转运蛋白 水平降低。在高原缺氧条件下，转运体的变化与药代动力学曲线以及药代动力学参数息息相关。罗冰峰等 发现，急进高原后，大鼠体内的转运体 表达发生变化，影响底物阿莫西林的药代动力学。药代动力学参数如 、和 等都有明显的变化。大鼠快速上升到高海拔后，呋塞米的药代动力学和有机阴离子转运蛋白 在肾脏中的表达水平发生了显著变化。表达的下调导致药物在人体内的停留时间延长。急性暴露于高海拔地区可能会显著影响呋塞米的肾脏排泄，并且在共同施用卡托普利后呋塞米的药代动力学参数被改变，这可能会影响常规治疗剂量 。黄隆基 研究发现，高原环境下常用降糖药物二甲双胍的药代动力学参数发生改变，引起变化的原因是肠和肝中转运体有机阳离子转运蛋白、有机阳离子转运蛋白 的转变。根据现有的研究，可证实高原缺氧环境中转运体水平发生了变化，但表观遗传学和转运体表达之间的调控关系不明确，未见相关文献报道。岳新瑞 发现，高原低氧条件下肝组织中转运体表达的变化差异，可能是转运体启动子部位的 甲基化水平的变化。作为分布广泛的转运体，底物众多。高原低氧环境下，底物左氧氟沙星 、丙戊酸 的药代动力学参数均会发生一定改变。表观遗传学调控转运体是近年来的研究热点，上述药物的药代曲线和参数发生的变化，是 变化导致的，其中 可能发挥了重要作用。此研究初步探究高原低氧环境下 与 之间的调控关系，以期进一步探究此条件下影响转运体表达的机制和相关药物药代动力学的变化，为高原居民的合理用药提供指导。参考文献：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：张明霞高原缺氧对血脑屏障中药物转运蛋白的影响 兰州：兰州大学，：，岳新瑞低氧条件下 甲基化调控药物转运体基因差异性转录的研究 兰州：兰州大学，：，中国药理学通报 ；（），（）：梁萌，郝萌，李轶，等基于时间序列筛选人进入高原后的差异基因和差异甲基化位点 基因组学与应用生物学，（）：，（）：，（）：刘洁高原低氧适应 甲基化谱及相关基因 功能研究 西宁：青海大学，：，（）：罗冰峰，张俊，杨涛，等高原急性缺氧对大鼠药物转运体 及阿莫西林药代动力学的影响 药学学报，（）：，（）：，（）：黄隆基高原低氧环境下常用降糖药物药代动力学特征及其影响因素的研究 兰州：兰州大学，：，王昌，贾正平，李文斌，等 法测定急进高原前后大鼠体内左氧氟沙星含量及其药代动力学差异 华中科技大学学报（医学版），（）：，（），（）：胡琳，赵安鹏，秦宁宁，等高原低氧对小鼠体内丙戊酸钠脑血分布的影响 中国药理学通报，（）：，（）：，（，；，；，）：，（），（），（），（），（），（），（），（），：；中国药理学通报 ；（）