24菌种改良.pptx

第四节第四节 生产菌种的改良生产菌种的改良菌种选育改良的目标菌种选育改良的目标提高目标产物的产量提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品改变生物合成途径，以获得高产的新产品菌种改良方法菌种改良方法诱变育种诱变育种细胞工程育种细胞工程育种杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术基因工程育种基因工程育种蛋白质工程育种蛋白质工程育种组合生物合成育种组合生物合成育种反向生物工程育种反向生物工程育种一、诱变育种一、诱变育种人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。工作相配合才能受到良好的效果。1.出发菌株的选择出发菌株的选择2.菌悬液的制备菌悬液的制备3.前培养前培养4.诱变诱变5.变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选（一）诱变育种中需考虑的若干因素（一）诱变育种中需考虑的若干因素1.1.选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株2.2.复合诱变剂的使用复合诱变剂的使用3.3.诱变剂剂量的选择诱变剂剂量的选择4.4.变异菌株的筛选变异菌株的筛选选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。从自然界分离得到的野生型菌株；从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；产菌株；已经诱变过的菌株。已经诱变过的菌株。诱变剂诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂各种射线，如紫外线、各种射线，如紫外线、X射线、射线、射线、射线、射线、射线、射线和超声波等射线和超声波等甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸、氮芥等。）、亚硝酸、氮芥等。诱变剂剂量诱变剂剂量既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。移动的剂量就是合适剂量。目前处理剂量已从以前采用的死亡率目前处理剂量已从以前采用的死亡率90909999减低为减低为70708080。诱变剂的选择主要根据已经成功的经验，与诱变剂的选择主要根据已经成功的经验，与诱变剂本身特点、菌种的种类和出发菌株的诱变剂本身特点、菌种的种类和出发菌株的遗传背景等有关。遗传背景等有关。各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂诱变剂的剂量诱变剂的剂量处理时间处理时间缓冲剂缓冲剂中止反应方法中止反应方法亚硝酸（亚硝酸（HNO2）0.010.1M510minpH值值4.5，1M醋酸缓冲醋酸缓冲液液pH8.6，0.07磷酸二氢钠磷酸二氢钠硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DES）0.511030min，孢子孢子1824hpH值值7.0，0.1M磷酸缓磷酸缓冲液冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯（EMS）0.050.5M1060min，孢子孢子36hpH值值7.0，0.1M磷酸缓磷酸缓冲液冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释亚硝基胍（亚硝基胍（NTG）0.11.0 mol/mL，孢子孢子3mg/mL1560min，90120minpH值值7.0，0.1M磷酸缓磷酸缓冲液或冲液或Tris缓冲液缓冲液大量稀释大量稀释羟胺（羟胺（NH2OHHCl）0.10.5数小时或生长数小时或生长过程中诱变过程中诱变大量稀释大量稀释氯化锂（氯化锂（LiCl）0.30.5加入培养基中，加入培养基中，在生长过程中在生长过程中诱变诱变大量稀释大量稀释秋水仙碱（秋水仙碱（C22H25NO6）0.010.2加入培养基中，加入培养基中，在生长过程中在生长过程中诱变诱变大量稀释大量稀释变异菌株的筛选变异菌株的筛选一般从菌落形态变异类型着手，发现与产量一般从菌落形态变异类型着手，发现与产量相关的特征相关的特征挑取一定数量的典型菌株复筛，确定各种类挑取一定数量的典型菌株复筛，确定各种类型与产量的关系型与产量的关系（二）筛选方法（二）筛选方法1.1.平皿快速检测法平皿快速检测法2.2.形态变异的利用形态变异的利用3.3.高通量筛选高通量筛选将许多模型固定在各自不同的载体上，用将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器加样，培养后，用计算机记录结果、机器加样，培养后，用计算机记录结果、分析。分析。特定的模型筛选特定的模型筛选基质金属蛋白酶抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂巨噬细胞泡沫化抑制剂巨噬细胞泡沫化抑制剂HIV-1整合酶抑制整合酶抑制 剂剂HIV-1蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酪氨酸磷酸酯酶蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B抑制剂抑制剂 Caspase-3抑制剂抑制剂 HsMetAP1抑制剂抑制剂 Caspase-7抑制抑制剂剂 PTPLAR抑制剂抑制剂 A549，LoVo肿瘤细胞筛选模型肿瘤细胞筛选模型（三）新诱变因子及诱变技术（三）新诱变因子及诱变技术1.低能离子束诱变低能离子束诱变通常采用通常采用N+、H+和和Ar+，相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变由于能量沉积引起机体损伤，或遗传物质原子转由于能量沉积引起机体损伤，或遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。移、重排或基因的缺失。2.激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变产生光、热、压力、电磁效应，引起产生光、热、压力、电磁效应，引起DNA或或RNA改变改变3.原生质体诱变原生质体诱变（二）细胞工程育种（二）细胞工程育种杂交育种杂交育种指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。和筛选出具有新性状的菌株。原生质体育种原生质体育种1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选u供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。以利于融合子的选择。u采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。状为标记。u通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。进行较细的筛选。营养缺陷型的筛选方法营养缺陷型的筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、逐个测定法、夹层平板法、夹层平板法、限量营养法限量营养法影印接种法等。影印接种法等。（三）基于代谢调节的育种技术（三）基于代谢调节的育种技术通过特定突变型的选育，达到改变代谢通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的生产或切通路、降低支路代谢终产物的生产或切断支路代谢途径、提高细胞膜的透性，断支路代谢途径、提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累的方向进行。使代谢流向目的产物积累的方向进行。组成型突变株的选育组成型突变株的选育限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养循环培养循环培养抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育流加葡萄糖、应用混合碳源等流加葡萄糖、应用混合碳源等抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育细胞膜透性突变株的选育细胞膜透性突变株的选育溶菌酶敏感型溶菌酶敏感型例如例如谷氨酸发酵中采用生物素（谷氨酸发酵中采用生物素（V VH H）缺陷型菌株）缺陷型菌株V VH H是乙酰是乙酰CoACoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成细胞膜细胞膜脂肪酸脂肪酸乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶乙酰乙酰CoA-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸VH透过透过（四）基因工程育种（四）基因工程育种体外重组体外重组DNADNA技术或称基因工程、技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。的生产菌株的潜力。1 1、基因工程的基本步骤、基因工程的基本步骤目的基因的分离目的基因的分离载体的选择与制备载体的选择与制备目的基因与载体连接成目的基因与载体连接成重组重组DNADNA引入宿主细胞引入宿主细胞重组体的选择和鉴定重组体的选择和鉴定外源基因的表达外源基因的表达原核表达系统常用：原核表达系统常用：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli），），枯枯草芽孢杆菌（草芽孢杆菌（B.subtilis）、链霉菌等）、链霉菌等真核表达系统常用：真核表达系统常用：酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），），巴斯德毕赤酵巴斯德毕赤酵母（母（Pichia pastoris）（五）蛋白质工程育种（五）蛋白质工程育种定点突变技术定点突变技术以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新蛋白质的氨基酸序列，应用重组设计新蛋白质的氨基酸序列，应用重组DNADNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶定点进化技术定点进化技术