细胞生物学实验.doc

实验室规则和要求
一般规定
1. 上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。
2. 在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。
3. 在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外套及杂物等。
4. 所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境清洁。
5. 实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。
6. 身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验室。
7. 实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验室前记得洗手。
8. 任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变措施。
药品
1. 使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料，查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。
2. 新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。
3. 挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、b-巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。
4. 有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好习惯。
5. 使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。
6. 使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 
仪器
1. 使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸，勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。
2. 使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。
3. 电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电源。
4. 使用微波炉加热，不可有铝箔等金属物品，瓶盖必须松开，以免爆炸。加热后戴防热手套取出瓶子，务必轻摇晃，确认不会突沸。水浴锅、干燥器等，使用前熟悉操作手续，严防烫伤。
5. 操作台上有酒精等有机溶剂及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离火苗，不可留置火焰燃烧，万一着火，应力持镇定，沉着处理。酒精或乙醚等着火时，应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖，勿使用水冲泼。
6. 实验完毕后需清理实验台，除需收回共用物品外，不留任何器皿。倾倒的试剂、水渍应擦干净，保证实验台和实验前同样清洁。
7. 值日组协助实验室管理人员收回共用物品，清洁仪器，清理实验台，打扫实验室。

第一部分 基础实验
实验1 显微技术概述
实验目的：
使学生了解基本的细胞生物学实验操作，熟悉常规和常用的实验方法。锻炼学生动手能力，增强学生基本科研技能和科研思路；了解目前常用细胞生物学研究方法。
任务：
细胞生物学作为高校生命科学的主干课程之一，从本质上讲是一门实验科学，因此设置实验课程十分重要，学生可以通过这一教学环节掌握细胞生物学的基本研究手段和方法，并更深入理解理论课的各方面内容。进一步讲，细胞是生物构成的基本单位，是理解一切生命现象的基础，许多细胞生物学实验方法也用于遗传学，分子生物学，生物化学等科学实验研究，在将来的各项工作中将会有广泛的实际用途。
培养目标：
使学生掌握细胞生物学实验技术，提高学生分析问题和解决问题的能力，为了今后独立进行科研工作打下坚实的基础。

实验2 细胞膜的渗透性
一、实验目的
了解细胞膜的渗透性质及各种物质跨膜进入细胞的不同速度
二、实验原理
将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质则不能渗入；渗入的溶质能够提高红细胞膜的渗透压，所以水分进入细胞引起溶血。由于溶质渗入速度不同，因此溶血的时间也不相同。
三、实验器材与试剂
器材：
50ml小烧杯，10ml移液管，试管（1～10ml），试管架。
试剂：
0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化铵，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/L草酸铵，0.12mol/L硫酸钠，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。
实验材料：
动物血液（如羊血）
四、实验步骤
1、羊血细胞悬浮液
取50ml小烧杯一只，加一份羊血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色溶液，即稀释的羊血。
2、低渗溶液
取试管一只，加入5ml蒸馏水，再加0.5ml稀释的羊血，注意观察溶液颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成溶血，全部红细胞溶血后光线比较容易透过溶液。
3、羊红细胞渗透性
（1）取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液5ml，再加入0.5ml稀释的羊血，轻轻摇动，观察颜色变化及溶血现象，说明原因。
（2）取试管一支，加入0.17mol/L氯化铵溶液5ml，再加入0.5ml稀释的羊血，轻轻摇动，观察颜色变化及溶血现象，说明原因。
（3）另外8种等渗溶液进行同上实验
记录实验结果并简单分析

表1 不同低渗溶液中红细胞溶血现象
溶液种类
溶血与否
时间
结果分析
0.17mol/L氯化钠

0.17mol/L氯化铵

0.17mol/L醋酸胺

0.17mol/L硝酸钠

0.12mol/L草酸铵

0.12mol/L硫酸钠

0.32mol/L葡萄糖

0.32mol/L甘油

0.32mol/L乙醇

0.32mol/L丙酮

五、注意事项（或实验特别提示）
六、实验报告
1、 结果与讨论
2、 思考题

实验3 细胞器线粒体的分离与观察
一、实验目的
用差速离心法分离动、植物细胞线粒体
二、实验原理
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
本实验介绍大鼠（动物）肝脏和玉米（植物）线粒体的分离。
三、实验器材与试剂
四、实验步骤

一、 大鼠肝脏线粒体的分离
实验用品
1、 材料：大鼠肝脏
2、 试剂：
（1） 生理盐水
（2） 1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制
（3） 蔗糖－Tris盐酸缓冲液（pH7.4）
0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）
0.1mol/L Tris 10ml
0.1mol/L 盐酸 8.4ml
加重蒸水到 100ml
加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖
0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）
配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。
（4） 固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）
（5） Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内，研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2h，令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用时吸出少量用1/15mol/L磷酸缓冲液作10～20倍稀释。
1/15mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）：
1/15mol/L KH2PO4 50ml
1/15mol/L Na2HPO4 50ml
3、 器材
高速离心机，解剖刀剪，小烧杯，冰浴盘，漏斗，尼龙织物，玻璃均浆器。

实验方法
1． 制备大鼠肝细胞匀浆。
实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0～4°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0~4°C条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆，蔗糖溶液分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

2． 差速离心
先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝匀浆使其覆盖在上层。用冷冻控温高速离心机按照图1顺序进行差速离心。

鼠肝匀浆700´g，离心10min
沉淀
上清
洗涤（可省略）
10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液，2次，每次1000´g，离心15min。
沉淀I
细胞核及质膜碎片
上清
合并
10000´g，离心10min
沉淀
洗涤（可省略）
加10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液，1000´g，15min。
沉淀II（线粒体）

图1 差速离心顺序图
3． 分离物鉴定
（1） 细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀释）染色10分钟。自来水冲洗，吹干，镜检。观察结果。
（2） 线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片镜检。观察结果。

二、 玉米线粒体的分离
从植物细胞中分离线粒体，除了做线粒体功能测定之外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。

分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心法。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。

实验用品
1、 材料
玉米黄化幼苗（水稻、高梁等幼苗均可）
2、 试剂
（1） 分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml BSA 。
50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）配法：
50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2） 保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）
（3） 20％次氯酸钠（NaClO）溶液
（4） 1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制。
3、 器材
温箱，冰箱，纱布，瓷研钵，冷冻控温高速离心机

实验方法
1、 玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持温度，置温箱28于暗处培育2～3d。待芽长到1～2cm长时剪下约5g，放0～41h。
2、 加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
3、 用多层纱布过滤，滤液经700´g离心10min。除去核和杂质沉淀。
4、 取上清液10000´g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
5、 沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆及离心均控制在0~4进行。
6、 取线粒体沉淀涂片在清洁载玻片上，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，镜下观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。

五、注意事项（或实验特别提示）
六、实验报告
1． 结果与讨论
2． 思考题

实验4 RNA的细胞化学（Brachet反应）
一、实验目的
了解Brachet反应原理，掌握有关的操作方法。
二、实验原理
甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。
三、实验器材与试剂
（1） 仪器、用具：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸。
（2） 材料：洋葱鳞茎内表皮。
（3） 试剂：
1） Unna试剂：甲基绿－派洛宁染色液
甲液：5％派洛宁水溶液 6ml
2％甲基绿水溶液 6ml
蒸馏水 16ml
乙液： 1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）16ml
甲液与乙液分别置于4冰箱备用，使用时两溶液混匀即可。
2） 1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）配方：
A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml。
B液：乙酸钠13.5g加蒸馏水至100ml。
取A液40ml＋B液60ml混匀即为pH4.8乙酸缓冲液。

四、实验步骤
（1） 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。
（2） 滴一滴Unna试剂，染色30min。
（3） 蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余水分。
（4） 盖上盖玻片，镜检。

五、注意事项（或实验特别提示）
CK对照：撕取洋葱鳞茎内表皮，经5％三氯乙酸90水浴处理15min。再经70％乙醇洗片刻，然后按照步骤（1）～（4）制片观察。
六、实验报告
1． 结果与讨论
2． 思考题
实验5 DNA的细胞化学（Feulgen反应）
一、实验目的
了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。
二、实验原理
DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核甘酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1mol/L盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是碱性品红和偏重亚硫酸钠作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物。因此凡是有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。
三、实验器材与试剂
（1） 仪器、用具：显微镜，恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。
（2） 材料：洋葱鳞茎。
（3） 试剂：
1） 1mol/L盐酸的配制：取82.5ml密度1.19g/ml的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。
2） Schiff试剂的配制和保存：称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使其沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中就加入10ml 1mol/LHCl，冷却至25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需2～3d），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1min，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可使用。
3） 亚硫酸水：取200ml自来水，加入10ml10％偏重亚硫酸钠（或钾）水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者于使用前混匀。
四、实验步骤
（1） 将洋葱鳞茎内表皮放在1mol/L HCl中，加热到60℃水解8～10min。
（2） 蒸馏水水洗。
（3） Schiff试剂遮光染色30min。
（4） 用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。
（5） 水洗5min。
（6） 显微镜观察。细胞中有DNA的部位应呈现紫红色阳性反应。
五、注意事项（或实验特别提示）
CK对照：另取同样材料一份，不经1mol/L HCl水解，直接在Schiff试剂中染色，然后按照步骤（4）～（6）制片观察。

六、实验报告
1． 结果与讨论
2． 思考题

实验6 考马斯亮蓝R250（Coomassie blue R250）染色法观察细胞骨架
一、实验目的
掌握动植物细胞内微丝的染色方法。
二、实验原理
真核细胞质中有错综复杂的纤维网，称为细胞骨架（cytoskeleton）。根据纤维的直径分为微丝（microfilament, MF, 7nm）、微管（microtubule, MT, 25nm）、中间纤维（intermediated filament, IF, 10nm）。此外，还散布着一些比微丝还细的纤维（3～6nm）。
目前观察细胞骨架的主要手段有电镜、间接免疫荧光技术、酶标、组织化学等。

微丝是肌动蛋白构成的纤维，称为F-actin。单根微丝直径约7nm，在光学显微镜下看不到。本实验观察到的是由微丝平行排列组成的纤维束，在动物细胞里称为“应力纤维”（stress fiber）应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达。一般当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，即应力纤维。应力纤维上还周期性地分布着微丝结合蛋白，包括-辅肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、类肌钙蛋白等。应力纤维的端部连接着质膜上的粘着斑，与加强细胞对基质的附着、铺展及维持细胞特定形状有关。

考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染色微丝，实验中用1％Triton X－100抽提掉胞质中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。
三、实验器材与试剂
四、实验步骤

一、 考马斯亮蓝R-250染动物细胞微丝
1、 仪器
光学显微镜、温箱、细胞培养设备
2、 材料
平皿，直径30mm小染缸，载波片，盖玻片条（剪掉一角以区别细胞正反面）。
体外培养的贴壁生长的HeLa细胞
3、 试剂
细胞培养基（DMEM、RPMI－1640等），磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.4），0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.3），M－缓冲液，1％Triton X-100（用M－缓冲液配制），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）。
4、 实验步骤
（1） 细胞培养在平皿中的盖玻片上，尚未致密时即可使用。取出盖玻片，用PBS洗3次。
（2） 用1％Triton X-100处理25～30min，室温或37度均可。
（3） 立即用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。
（4） 略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞5～15min。
（5） PBS洗数次，滤纸吸干。
（6） 用0.2%考马斯亮蓝R250染色1小时，然后用水小心冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。
（7） 普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。
二、 考马斯亮蓝R-250染植物细胞微丝
实验步骤：
1、 取洋葱鳞茎表皮，大小约1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液（6.8）的小烧杯中。
2、 吸去缓冲液，用1％Triton X-100处理洋葱表皮20～30min。
3、 除去Triton X-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10min。
4、 加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制，pH6.8）固定0.5~1h。
5、 用PBS洗3次，滤纸吸去残液。
6、 0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。
7、 蒸馏水洗数遍。将样品置于载玻片上，加盖玻片，光学显微镜下观察。

五、注意事项（或实验特别提示）
六、实验报告
1． 结果与讨论
2． 思考题
实验7 动物细胞传代培养与观察实验
一、实验目的
熟练掌握细胞的传代培养法。
二、实验原理
传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。
三、实验器材与试剂
1. 材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
2. 药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶。
3. 仪器：C02培养箱，倒置显微镜，超净工作台。
四、实验步骤
1．人进入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项（或实验特别提示）
1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折旋光性好，生长致密时即可传代。
3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
六、实验报告
1、结果与讨论
2、思考题

第二部分 综合实验
实验8 MTT 法检测化学药物对体外培养细胞增殖及存活的影响
一、实验目的
了解掌握MTA法的基本原理及基本过程。
二、实验原理
测试药物对细胞增殖的影响，对细胞的杀伤作用，一般采用集落形成法，生长曲线法等。这些方法作用量大，费时对于处理大量样品和受试对象，则更为繁琐。1983年，T.Mosmann结合微空培养方法，利用细胞对tetrazolium(简称MTT)的还原作用，建立了比色检测法。经过以后的改进，特别是M.C.Alley(1988)的研究，逐渐成熟，称为Microculture Tetrazolium Assay，简称MTA。该法快速、简便、使用面广。在适当的实验条件下，结果重复性好，敏感性高。对于大规模筛选药物，可在短时间内处理大量样品。
MTA法是利用活细胞线粒体中呼吸链对tetrazolium的还原作用而生成有色的MTT forrmazan，其生成量与活细胞数量、细胞的种类、作用时间等相关。当细胞种类、作用时间一定时，则MTT formazan的生成量与细胞数量呈直线相关。比色测定MTT formazan的量就可测知活细胞数量。此法与集落形成法、生长曲线法等的测定结果有良好的相关性。
三、实验器材与试剂
一、 器材
微孔细胞培养板、微量加样器、酶联免疫检测仪、显微镜、细胞计数板。
二、 材料
HeLa细胞株。
三、 试剂
1．培养液
2％RPMI1640 85ml
小牛血清 15ml
青霉素 10000IU
链霉素 10mg
2． 2mg/ml MTT
MTT200mg，加入培养液100ml溶解后，用黑纸包好贮存于4℃。
3． 3％小牛血清－磷酸缓冲盐水（3％FCS-PBS）
PBS :NaCl 7.6g
KCl 0.15g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KH2PO4 0.15g
加蒸馏水至 1000ml
取PBS 970ml加灭活小牛血清30ml。
四、实验步骤
1.细胞接种：将处于对数生长期的细胞用培养基制成2×105细胞/ml的悬液。用微量加样器接种于微孔板中，每孔100ul，边缘孔中不加细胞，仅加培养基作为无细胞空白。37±0.5℃过夜或5％CO2培养箱中4h，使细胞贴壁。
2.加药：弃去培养液，于相应实验孔中加入一定浓度的H2O2，每孔100ul，留CK孔不加药，而加入等体积培养液作空白对照。继续培养24h。
3.加MTT，倾弃药液，每孔中加入200ul培养基洗一次，3min后倾弃，每孔加入MTT溶液50ul，继续培养3-4 h。
4． 洗板：倾去MTT，以3％FCS-PBS洗二次，每次每孔约加入200ul。最后倾干孔内液体。
5． 溶解：每孔加入DMSO（二甲基亚砜）200ul，室温放置30min，并不时摇动。
6． 测量：以无细胞空白孔为零点，测量OD550或OD570，做好记录。
7． 以空白对照为100％，按下式计算细胞的存活率：

存活率%=×100%
五、注意事项（或实验特别提示）
六、实验报告
1． 结果与讨论
2． 思考题