甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因FAH的克隆、功能鉴定和表达分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):115-127收稿日期：20230324基金项目：国家自然科学基金项目（31760301），江西省科技厅重点研发计划（20212BBF63014），江西省教育厅科技项目（GJJ190872）作者简介：支添添，女，博士，讲师，研究方向：甘蓝型油菜和拟南芥酪氨酸缺陷突变体 sscd1 抗病机制；Email:；支添添同时为本文通讯作者甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因 FAH 的克隆、功能 鉴定和表达分析支添添1 周舟1 陈纪鹏1 韩成云2（1.宜春学院生命科学与资源环境学院 宜春学院江西省作物生长发育调控重点实验室，宜春 336000；2.宜春学院化学与生物工程学院，宜春 336000）摘 要：克隆甘蓝型油菜（Brassica napus L.）酪氨酸代谢关键基因 FAH，对其进行功能验证和表达分析，为进一步解析FAH 在甘蓝型油菜中的作用和功能提供理论依据。以甘蓝型油菜westar为试材，克隆与拟南芥 AtFAH 同源性最高的甘蓝型油菜FAH 基因 BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和 BnaC05g49430D（BnaC05FAH），通过生物信息学分析其亲缘关系，构建过表达载体转化拟南芥突变体 sscd1 进行功能验证。克隆 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子序列，利用 PlantCare 在线数据库分析启动子调控元件，构建启动子和 GUS 的融合载体，通过 GUS 组织化学染色分析其表达模式。结果显示，BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 与 AtFAH 的氨基酸序列相似性分别为 93.11%和 92.40%，2 个基因过表达都可以完全抑制拟南芥突变体 sscd1 在短日照下模拟病斑的形成，暗示BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 都与 AtFAH 功能相似。BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子除具有所必需的 TATAbox 和 CAATbox 等基本顺式作用元件外，都含有多个与光诱导、激素响应和逆境胁迫响应元件以及多种与抗病相关的顺式作用元件，但与 BnaA06FAH相比，BnaC05FAH 与拟南芥 AtFAH 相同的顺式作用元件更多；GUS 活性检测表明，BnaC05FAH 启动子驱动的 GUS 基因的表达比BnaA06FAH 强，并且两者驱动表达的组织部位不完全相同。因此，BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子的作用部位和作用强度都存在明显差异。BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 都能够调控拟南芥 sscd1 模拟病斑的形成，但两者启动子驱动下游基因的强度和部位不同。关键词：甘蓝型油菜；FAH；功能鉴定；酪氨酸降解DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230270Cloning,Functional Identification and Expression Analysis of FAH,a Key Gene for Tyrosine Metabolism in Brassica napus L.ZHI Tiantian1 ZHOU Zhou1 CHEN Jipeng1 HAN Chengyun2（1.College of Life Science and Resources and Environment,Yichun University,Key Laboratory of Crop Growth and Development Regulation,Yichun University,Yichun 336000;2.College of Chemistry and Bioengineering,Yichun University,Yichun 336000）Abstract:The objective of this work is to clone the tyrosine metabolism key gene FAH in Brassica napus L.,identify its function and analyze its expression,so as to provide theoretical evidence for further understanding the role and function of FAH in B.napus L.Two FAH genes BnaA06g38260D（BnaA06FAH）and BnaC05g49430D（BnaC05FAH）,which was the highest protein homology to AtFAH in Arabidopsis,were cloned from the B.napus L.varietywestar,the phylogenetic relationship was analyzed by bioinformatics,and the overexpression vector was constructed and transformed into Arabidopsis mutant sscd1 for function verification;the promoter sequences of two FAH genes BnaA06FAH and BnaC05FAH were cloned.PlantCARE was used to analyze the promoter cisacting elements,and the fusion expression vector of gene promoter and GUS was constructed to analyze its expression patterns.As results,the amino acid sequence similarity of BnaA06FAH,BnaC05FAH and AtFAH was 93.11%and 92.40%respectively,the overexpressions of BnaA06FAH and BnaC05FAH completely inhibited the 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10116酪氨酸降解途径在动物中必不可少，若中断将导致严重的代谢疾病1-3。这条途径首先在动物和细菌中被发现4-5，是一条非常重要的代谢途径。Dixon 等6证 明 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）中存在酪氨酸降解途径的关键酶，并且和动物中有相同的功能。越来越多的证据表明，植物具有典型的酪氨酸分解代谢途径7-13。延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）是 酪 氨 酸代谢途径的最后一个酶，FAH（SSCD1）基因的突变导致拟南芥在短日照下产生模拟病斑并激活植物 防御11-12。模拟病斑突变体是一类在没有明显的逆境、损伤或病原物侵害时，在叶片上能自发地形成类似病原物侵染后的坏死斑的突变体，这类突变体在植物中广泛存在，如拟南芥、水稻（Oryza sativa）、玉 米（Zea mays）、高 粱（Sorghum bicolor）、小 麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）等中均有报道14-19。这些突变体往往能激活植物体的系统获得性抗性，通常具有与抗病反应相关的细胞学和生物化学特征，对许多病原物表现出局部和系统抗性，是研究植物抗病机理的理想材料20，如 bon1（bonzai1）和 cpr1/cpr30 模拟病斑突变体对丁香假单胞菌有抗性21-22。水稻模拟病斑突变体 oscul3a 对稻瘟病菌和黄单胞菌均有很强的抗性23，大麦 mlo突变体对白粉病具有非特异性抗性24，小麦模拟病斑突变体 Ning7840 和 lm3 分别对叶锈病和白粉病具有抗性25-26。研究表明模拟病斑突变体的抗病性与植物抗病信号中的水杨酸（salicylic Acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）、乙烯（ethylene,ET）等信号分子均有相关，这些植物激素不同程度地参与了抗病过程中的不同环节，起着非常重要的作用27-32。前期研究证实sscd1 突变体产生模拟病斑的同时积累 JA，同时激活调控 JA/ET 信号途径的部分病程相关基因 PDF1.2，VSP1 和 SA 病程相关基因 PR112。尽管 sscd1 中的模拟病斑的产生伴随着 SA 诱导基因 PR1 的上调，但与 SA 信号转导无关；而 JA 信号通路的中断显著抑制 sscd1 模拟病斑的产生12。这些结果说明 FAH基因突变在短日照下激活拟南芥抗病信号途径从而调控植物抗病。甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是我国重要的油料作物，是第一大国产食用植物油来源和我国第二大饲用蛋白源33。然而，各种病害的频繁发生严重影响着油菜的产量和品质34。因此，挖掘油菜抗病相关遗传资源、提高油菜抗病性对于油菜生产具有重要意义。甘蓝型油菜是白菜（Brassica rapa,AA,2n=20）和 甘 蓝（Brassica oleracea,CC,2n=18）通过自然杂交形成的异源四倍体作物（AACC,2n=4X=38）35-36，白菜和甘蓝的基因组在古老的多倍化事件中都经历了 3 倍化的过程37。因此，甘蓝型油菜相比拟南芥，具有更加复杂的基因组特征并且大多数基因具有多个同源拷贝，具有冗余或不同的功能38。尽管在拟南芥中已证实 FAH 基因突变在短日照下产生模拟病斑并激活抗病反应，但鉴于甘蓝型油菜相比拟南芥基因组更复杂，仍需要鉴定不同 FAH 基因在甘蓝型油菜中的功能并分析其各自的表达模式。本研究从甘蓝型油菜克隆了 2 个与拟南芥高度同源的 FAH 基因 BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH），通过生物信息学分析其编码的蛋白质序列和进化关系；构建过表达载体转化拟南芥突变体 sscd1 进行功能验证；进一步对mimic lesion in sscd1 under shortday condition,suggesting both BnaA06FAH and BnaC05FAH had high structural and functional similarity with AtFAH.BnaA06FAH and BnaC05FAH promoters had the core elements of eukaryotic promoter TATAbox and CAATbox,and also contained several cisacting elements related to stress,hormone,stress response and a variety of cisacting elements related to disease resistance,however,BnaC05FAH promoter shared more cisacting elements with Arabidopsis AtFAH than with BnaA06FAH.GUS activity assays indicated BnaC05FAH promoter drove the expression of GUS gene stronger than BnaA06FAH,and the site of GUS gene expression drove by two different promoters were not completely consistent.Conclusively,there were differences in the sites and intensity where BnaA06FAH and BnaC05FAH promoters functioned.The results showed that both BnaA06FAH and BnaC05FAH played a role in regulating lesion mimic in the sscd1 mutant,but the expression of gene downstream and the expression site drove by BnaA06FAH and BnaC05FAH promoters was different.Keywords:Brassica napus L.;fumarylacetoacetate hydrolase;functional identification;tyrosine degradation2023,39(10)117支添添等：甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因 FAH 的克隆、功能鉴定和表达分析BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子进行克隆，探究其序列特征和潜在的响应元件，构建含有报告基因GUS 的植物表达载体，通过 GUS 染色揭示其表达模式，为深入研究 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 在甘蓝型油菜中的作用和功能奠定基础。1 材料与方法1.1 材料甘蓝型油菜品种为 westar、拟南芥（Arabidopsis thaliana）生 态 型 为 哥 伦 比 亚（Columbia,Col0），突变体 sscd1、大肠杆菌菌株 DH5、农杆菌菌株GV3101、启动子分析载体 pCAMBIA1301 和过表达载体 pBI121 均由宜春学院江西省作物生长发育调控重点实验室保存。拟南芥 sscd1 突变体在短日照下产生模拟病斑11。1.2 方法1.2.1 DNA、RNA 的提取及 cDNA 合成 待甘蓝型油菜长到四叶期，取适量的新鲜的叶片用液氮研磨，用高效植物基因组 DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取叶片基因组 DNA，使用分光光度 计（ND1000,NanoDrop,Thermo Fisher Scientific）检测浓度后储存于 20，用作克隆启动子序列的模板；用 Trizol（RNAiso Plus,宝生物工程有限公司）提取总 RNA，进一步用 DNase I（RNase Free,Thermo Fisher Scientific）去除基因组 DNA 后利用反转录试剂盒 ReverTraAce qPCR RT 试剂盒（perfect real time,Toyobo），将 RNA 反转录成 cDNA，用作克隆 CDS 序列的模板。1.2.2 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的 CDS 序列和启动子的克隆以及载体的构建与转化1.2.2.1 引物设计及目的片段的扩增 在甘蓝型油菜数据库（https:/s.fr/brassicanapus/）中获得 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的 cDNA 预测序列。利用软件 Primer premier 5.0 在 2 个基因非编码区设计特异引物（表 1），用 TaKaRa 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增，以扩增得到的 cDNA 为模板，在 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 上游引物的 5 添加Xba I（TCTAGA）限制性内切酶和保护碱基（GC）以及下游引物 5 添加 Sac I（GAGCTC）限制性内切酶和保护碱基（C）（引物见表 1），再次进行 CDS 序列的 PCR 扩增，目的片段大小预期为 1 266 bp，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测、回收并纯化，测序。在 NCBI 中 获 得 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 翻译起始位点 ATG 上游 1.8 kb 左右的 DNA 序列，根据启动子序列，利用软件 Primer premier 5.0 分别设计扩增引物（表 1），在上下游引物的 5 端分别加上Xba I 和 Bgl II 酶切位点及其保护碱基，以westar总 DNA 为模板进行 PCR 扩增，目的片段大小预期为 1 980 bp（BnaA06FAH）和 1 708 bp（BnaC05FAH），经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测、回收并纯化，测序。表 1 试验所用引物Table 1 Primers used in the experiment引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence（5-3）BnaC05FAHtyFAACCTACCACTGCCCTTTBnaC05FAHtyRTTTCCACCAACTTCCTGCBnaA06FAHtyFACCATACATCATCCGTTTBnaA06FAHtyRTCAAGGCAGTGAAGGTAAAABnaC05FAHXba I FGCTCTAGACCATGGCGTTGCTCAAGTCTTTBnaC05FAHSac I RCGAGCTCCATCAAGGCAGTGAAGGTAAAABnaA06FAHXba I FGCTCTAGAATGGCGTTGCTCAAGTCTTTCGBnaA06FAHSac I RCGAGCTCTCAAGGCAGTGAAGGTAAAATBnaC05FAHproXba I FGCTCTAGATTAAGGTAATGCTTTGATTCGBnaC05FAHproBgl II RGGAAGATCTGGACGATAAACAAACAGATBnaA06FAHproXba I FGCTCTAGAAGTTCCCTAACGTTGTCCTCACTTTBnaA06FAHproBgl II RGGAAGATCTTGTATGACGAAGTTTCCAAAGCqBnaC05FAHFAACCTACCACTGCCCTTTqBnaC05FAHRCGTATGACGATGTTTCCGqBnaA06FAHFTTTGGAAACTTCACCGAGqBnaA06FAHRGAGTGTGGAGCAACATCGACTIN2F AGCACTTGCACCAAGCAGCATGACTIN2RACGATTCCTGGACCTGCCTCATC注：下划线为酶切位点Note:Underline refers to the restriction enzyme cutting size1.2.2.2 35SBnaC05FAH 和 35SBnaA06FAH 重组载体的构建 用限制性内切酶 Xba I 和 Sac I 对已测序验证的 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的 CDS 序列和生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10118pBI121 载体分别进行双酶切，然后将目的片段和载体进行连接，使目的基因替换原载体上的 GUS，构建 35SBnaC05FAH 和 35SBnaA06FAH 过表达载体，转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，挑取菌落进行 PCR 鉴定，对鉴定的阳性菌落进行测序，以确保载体构建的准确性。1.2.2.3 pBnaC05FAHGUS 和 pBnaA06FAHGUS重组载体的构建 用限制性内切酶 Xba I 和 Bgl II对已测序验证的 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的启动子序列及 pCAMBIA1301 载体进行双酶切，然后进行连接，用 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子替换pCAMBIA1301 载体上原有 35S 启动子。通过热激法将连接产物转化至大肠杆菌 DH5，随机挑选阳性克隆进行菌落 PCR 及酶切检测，测序。将测序验证正确的阳性克隆进行摇菌和质粒提取。1.2.2.4 拟南芥的遗传转化及筛选 用 CaCl2冻融法将已验证的重组质粒转入农杆菌 GV3101，挑选菌落 PCR 验证正确的农杆菌单菌落进行培养，28、220 r/min 振荡培养 18-24 h。7 352 r/min 离心活化菌液 2 min，弃上清，用农杆菌悬浮液（5%蔗糖+1/2 MS+0.02%SilwetL77+0.01%6BA）将菌体重悬至OD600为 0.6-1.0。利用浸花法转化拟南芥，收取 T0代种子，在含有潮霉素（25 mg/L）或卡那霉素（50 mg/L）的 MS 培养基上筛选成功转入表达载体的转基因植株，将筛选到的转基因植株 T0代抗性苗移入土中，后代单株收种。挑选 T2代抗性符合 31 分离比的转基因株系，用 GUS 组织化学法检测启动子活性。1.2.3 生物信息学分析 PLANTCARE 在线分析启动子序列包含的顺式作用元件（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。用 Bioxm2.7 软件分析 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 序列的开放阅读框（open reading frame,ORF）。从 NCBI 数据库中下载不同物种FAH蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0软件对氨基酸序列进行比对，用 MEGA 11.0 软件对氨基酸序列进行系统进化树分析。1.2.4 GUS 组织染色 根据潮霉素抗性在 MS 固体 培 养 基 上 筛 选 pBnaC05FAHGUS 和 pBnaA 06FAHGUS 转基因拟南芥至 T3代，用 GUS 染色液（GUS Blue KIT,北京华越洋生物科技有限公司）对 MS 培养基上 9 和 14 d 的拟南芥进行 GUS 染色，并将 14 d 幼苗移栽到土中生长至抽薹开花，剪下茎前端进行染色：将拟南芥被配置好的染色液完全覆盖，抽真空 2-3 次，每次 10 min 后，用锡箔纸包好，37孵育 24 h，70%乙醇脱色 3 d，每天更换到脱色完全。染色结束后将植株置于体式显微镜下（Nikon SMZ800N）观察并拍照记录。1.2.5 RTqPCR 采 用 SYBR qPCR 混 合 试 剂 盒（Toyobo）和 ABI 7300 序 列 检 测 系 统（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）按照说明书进行实时定量 PCR。RTqPCR 检测的基因引物见表 1，以ACTIN2 作为内参。每个样本的基因表达量在 3 次分析重复中计算，相对表达量用 2-Ct方法定量。所有试验至少重复 3 次。表中的数据表示为 RTqPCR中 3 次生物重复的平均值 SE。2 结果2.1 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列扩增根据 AtFAH 氨基酸序列，通过 BnIR（Brassica napus multiomics information resource）进 行 BLAST比对，获得同源性最高的 2 个甘蓝型油菜（Brassica napus L.）FAH 基因：BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和 BnaC05g49430D（BnaC05FAH）。根 据 基 因cDNA 序列设计引物，以甘蓝型油菜品种westar叶片 cDNA 为模板进行扩增，获得 BnaA06FAH 和BnaC05FAH 的 CDS 序列（图 1），测序。M150010001M25000bpM：DNA marker;1:BnaA06FAH;2:BnaC05FAH 图 1 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH CDS 序列的 PCR 扩增Fig.1 PCR products of CDS sequences of BnaA06FAH and BnaC05FAH2.2 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列生物 信息学分析测序后的 CDS 序列翻译成氨基酸序列，与拟南2023,39(10)119支添添等：甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因 FAH 的克隆、功能鉴定和表达分析芥 AtFAH（NP 172669.2）进行同源比对，同源性分别为 93.11%和 92.40%（图 2A）。基于 BnaA06FAH和 BnaC05FAH 的氨基酸序列，与萝卜、拟南芥、荠菜、亚麻芥、玉米和短花药野生稻的 FAH 基因全长预测氨基酸序列构建系统进化树，结果（图 2B）显示，甘蓝型油菜中该基因与白菜和甘蓝的亲缘关系最近，其次是萝卜，再而是拟南芥，与单子叶植物的亲缘关系较远。2.3 BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能验证为了验证 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的功能，?ABnaA06g38260D(CDY53351.1)?Brassica rapa(XP 009148616.1)BnaC05g49430D(XP 013686604.1)?Brassica oleracea var.oleracea(XP 013638135.1)?Raphanus sativus(XP 018483238.1)?Arabidopsis thaliana(NP 172669.2)?Capsellarubella(XP 006307619.1)?Camelina sativa(XP 010476162.1)?Zea mays(NP 001131569.1)?Oryza brachyantha(XP 006647024.1)B93939393939393图 2 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 氨基酸序列比对（A）和进化树分析（B）Fig.2 Amino acid sequences alignment（A）and phylogenetic tree（B）of BnaA06FAH and BnaC05FAH生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10120构建 35SBnaA06FAH 和 35SBnaC05FAH 过表达载体，通过浸花法转入拟南芥 sscd1 突变体，以 T2代纯合株系的莲座叶 cDNA 为模板，分别选择 4 个独立株系进行荧光定量 PCR 分析，结果（图 3）显示，BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 在 sscd1 突 变 体 中本身无表达，其相对表达量为 0；拟南芥突变体sscd1 转 基 因 植 株 中 35SBnaA06FAHsscd172 和35SBnaC05FAHsscd1411 的相对表达量最高，作为后续试验的研究材料。当在拟南芥 sscd1 突变体中过表达甘蓝型油菜BnaA06FAH 和 BnaC05FAH，sscd1 突变体在短日照下的模拟病斑完全被抑制（图 4）。结果表明，甘蓝型油菜 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的功能都与拟南芥 AtFAH 相似。2.4 BnaA06FAH和BnaC05FAH启动子序列的扩增和生物信息学分析在甘蓝型油菜数据库和 NCBI 中获得 BnaA 06FAH 和 BnaC05FAH 对 应 的 基 因 组 序 列，选 取ATG 上游 1.8 kb 左右的序列。以甘蓝型油菜 westar基因组 DNA 为模板，设计特异性的引物进行 PCR扩增（表 1），分别获得 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH的启动子片段（图 5）。在 TAIR（http:/www.arabidopsis.org/）网站获得拟南芥AtFAH基因（AT1G12050）ATG 上游 1.8 kb 的启动子序列，通过 PlantCARE（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库在线分析，并与 BnaA06FAH 和 BnaC 05FAH 启动子顺式作用元件进行比较。结果发现，BnaA06FAH、BnaC05FAH 和 AtFAH 启动子序列除了都含有基本转录元件 CAATbox、TATAbox 外，还含有多种应答元件。应答元件又可分为生长发育、光响应、胁迫响应和激素响应 4 类元件（图 6），说明甘蓝型油菜 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 和拟南芥AtFAH 的表达都可能响应光、植物激素和胁迫的诱导。生长发育类别中，涉及胚乳表达（AAGAAmotif）、昼夜节律（circadian）和玉米醇溶蛋白代谢（O2site）等，其中 O2site 占比例最高，为 43%。光响应有 12 种顺式作用元件，包括 AEbox、AT1motif、ATCTmotif、Box 4、GBox、Gbox、GAmotif、GT1motif、Sp1、TCTmotif 和 MRE，其中 Gbox 占比最大，为 21%。胁迫响应类别有 6 种顺式作用元件，分别与防御应激（STRE、as1）、厌氧诱导（ARE）、脱水（DRE core）、创伤（WRE3 和 WUNmotif）和病原诱导（Wbox）相关，其中 as1 和 WRE3 所占的比例最高，为 32%。激素响应类别中的元件包括脱落 酸（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、生 长 素（TGAelement、TGAbox）、赤霉素（GAREmotif）、茉莉酸01234567891002468101214Relative expression Relative expression ABBnaA06FAHBnaC05FAHcbbaaabb?sscd135SBnaA06FAH-sscd1 9-1135SBnaA06FAH-sscd1 16-635SBnaA06FAH-sscd1 8-335SBnaA06FAH-sscd1 7-2sscd135SBnaC05FAH-sscd1 2-735SBnaC05FAH-sscd1 7-735SBnaC05FAH-sscd1 24-935SBnaC05FAH-sscd1 4-11不同小写字母表示差异显著（P0.05）Different lowercases indicate significant difference（P0.05）图 3 过表达拟南芥株系中 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的相对表达量Fig 3 Relative expressions of BnaA06FAH and BnaC05 FAH in overexpressed A.thaliana line2023,39(10)121支添添等：甘蓝型油菜酪氨酸代谢关键基因 FAH 的克隆、功能鉴定和表达分析甲酯（CGTCAmotif、TGACGmotif）应答元件，其中响应茉莉酸甲酯的顺式作用元件占比最大，为25%。另外，这些应答元件还参与抗病响应，如Wbox、ERE、GT1motif、Gbox、as1、TGACGmotif 和CGTCAmotif，其 中 BnaA06FAH、BnaC05FAH 和拟南芥 AtFAH 共有的启动子顺式作用元件有 as1、GT1motif、TGACGmotif 和 CGTCAmotif，说明无论拟南芥还是甘蓝型油菜 FAH 基因的表达很可能与植物抗病性相关。BnaA06FAH 相比 BnaC05FAH 与拟南芥 AtFAH启动子共同拥有更多顺式作用元件，如激素响应顺式作用元件（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、光响应元件（Sp1 和 Gbox）、脱水响应元件（DRE core）和创伤响应元件（WRE3,表 2）。除了两者共同的启动子顺式元件，两者都存在特异的启动子顺式作用元件：BnaC05FAH 特异的大部分都是光响应元件（如AEbox、GAmotif 和 AT1motif）；而 BnaA06FAH 没 有光响应元件，有激素防御相关（GAREmotif、TGAelement、Wbox）诱导和与生长发育相关的顺式调控元件（表 3）。说明甘蓝型油菜 BnaA06FAH和 BnaC05FAH 的表达调控可能存在差异。2.5 BnaA06FAH和BnaC05FAH表达模式分析为 了 探 明 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 的 表 达模 式，构 建 BnaA06FAHProGUS 和 BnaC05FAH ProGUS 融合表达载体，通过电击法转入根癌农杆菌 GV3101 中，并通过农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥 Col0，利用潮霉素抗性筛选转基因拟南芥至 T3代，同时以未转入任何载体的 GV3101菌株侵染的拟南芥作为阴性对照（CK）。分别对生长 9 和 14 d 的 T3代阳性和阴性植株幼苗、花和角果进行 GUS 组织化学染色，在实体显微镜下观察染色情况。结果（图 7）显示，在 9 d 的幼苗中，转化 BnaC05FAHProGUS 和 BnaA06FAHProGUS 的阳性植株都在子叶、叶柄、下胚轴和根部位检测到GUS 的表达；待植株生长至 14 d，BnaC05FAHPro驱 动 的 GUS 几 乎 在 所 有 部 位 都 有 表 达，而BnaA06FAHProGUS 转基因植株中 GUS 表达集中在子叶、幼嫩的真叶、下胚轴以及根。对花的染色结果显示，BnaC05FAHProGUS 转基因植株中 GUS在茎秆、花萼、花丝，雌蕊的柱头、花柱和子房中表达，相比之下，BnaA06FAHProGUS 转基因植株的表达部位只集中在茎秆、花萼、花柱和子房，而柱头、花药、花丝和花瓣都没有表达；二者幼嫩角果里的胚珠都可以染色，但 BnaC05FAHProGUS转基因植株角果的心皮上也有染色。表达强度上，转化 BnaA06FAH 启动子的阳性苗组织蓝色斑点颜sscd1Col-035S:BnaA06FAH-sscd1 7-235S:BnaC05FAH-sscd1 4-11ABsscd1Col-035S:BnaA06FAH-sscd1 7-235S:BnaC05FAH-sscd1 4-11A：短日照下生长 10 d 的幼苗；B：长日照下生长 20 d 转入短日照 3 d 的莲座叶A:Seedlings grown for 10 d under short day condition;B:rosettes grow under long day condition for 20 d then transferred to short day for 3 d图 4 短日照下过表达 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 抑制拟南芥突变体 sscd1 的模拟病斑Fig.4 Overexpressions of BnaA06FAH and BnaC05FAH repress the simulated disease spot in Arabidopsis mutant sscd1 under short-day condition2000 bp1500 bpM1M2M:DNA marker;1:BnaA06FAH promotor;2:BnaC05FAH promotor图 5 BnaA06FAH 和 BnaC05FAH 启动子的 PCR 扩增产物Fig.5 PCR products of BnaA06FAH and BnaC05FAH promotors生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10122色在所有时期均比转 BnaC05FAH 启动子的阳性苗浅，说明 BnaC05FAH 启动子对 GUS 的驱动强度明显比 BnaA06FAH 强。综上所述，BnaA06FAH 和BnaC05FAH 启动子驱动 GUS 在拟南芥中的表达在无论其组织部位还是强度上都存在明显差异。3 讨论油菜是仅次于玉米和油棕的第三大重要油料作物39。甘蓝型油菜具有株型高大或较高大，单产高和适应性强等优良特性，成为我国和全世界主要栽培和种植的油菜类型40。但是，在甘蓝型油菜的生CAAT-boxTATA-boxA-boxAAGAA-motifAC-IcircadianO2-siteW boxAE-boxAT1-motifATCT-motifBox 4G-BoxG-boxGA-motifGT1-motifSp1TCT-motifMRESTREAREDRE coreWRE3W