复方沙棘籽油加速大鼠肛周脓肿术后创面修复的作用机制研究.pdf

中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期复方沙棘籽油加速大鼠肛周脓肿术后创面修复的作用机制研究邵书先1，王东1，杨关根1，裘建明1，袁玥旻1，何瑾2摘要目的：探讨复方沙棘籽油加速大鼠肛周脓肿术后创面修复的作用机制。方法：取制备成功肛周脓肿术后创面 SD 模型鼠共 50 只，随机分为 5 组，分别为模型组（G1，给予蒸馏水）；阳性对照组（G2，给予高锰酸钾）；复方沙棘籽油纳米乳化液低剂量治疗组（G3）；复方沙棘籽油纳米乳化液中剂量治疗组（G4）；复方沙棘籽油纳米乳化液高剂量治疗组（G5）；造模后各组实验大鼠创面用相应实验药物均匀涂抹，2 次/d，连续给药 14 d。观察治疗 5 d、8 d、14 d 后各组大鼠创面愈合情况，计算各组大鼠创面愈合率，分别取各组大鼠创面组织，应用免疫组化 S-P 法检测创面表皮生长因子（EGF）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、白细胞介素-8（IL-8）、前列腺素 E2（PGE2）表达情况。结果：创面处理后 5 d、8 d、14 d，G5 组、G4 组、G3 组、G2 组、G1 组大鼠创面愈合率依次升高(均约0.05)。术后 14 d，大鼠创面 IL-8 表达水平为 G2 组约G5 组约G4 组约G3 组约G1 组(约0.05)；PEG2 表达水平为 G5 组约G2 组约G4 组约G3 组约G1 组(约0.05)。术后 14 d，大鼠创面 EGF、ERK1/2 表达为 G5 组 G4 组 G3组 G2 组 G1 组(均约0.05)。结论：复方沙棘籽油纳米乳化液可有效促进大鼠肛周脓肿术后创面愈合，这可能与 IL-8 及PEG2 炎症介质有关，还可能与 EGF-ERK 通路活化促进创面角质形成细胞、成纤维细胞生长、增殖、分化有关。关键词：复方沙棘籽油；肛周脓肿；创面修复；表皮生长因子；细胞外调节蛋白激酶中图分类号：R657.1+5；Q95-33文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1007-6948.2023.05.019Mechanism of compound seabuckthorn seed oil accelerating postoperative wound repair of perianalabscess in ratsSHAO Shu-xian，WANG Dong,YANG Guan-gen,et al.Abstract:ObjectiveTo study the effect of compound seabuckthorn seed oil on accelerating wound healingafter perianal abscess surgery in rats.MethodsA total of 50 SD model mice were used to successfullyprepare postoperative wounds of perianal abscess.They were randomly divided into five groups:G1 model group(given distilled water);G2 positive control group(given potassium permanganate);G3 treatment group(low dosegroup of compound seabuckthorn seed oil nano-emulsion);G4 treatment group(middle dose group of compoundseabuckthorn seed oil nano-emulsion);G5(high dose group of compound seabuckthorn seed oil nano-emulsion).After modeling,the wounds of experimental rats in each group were evenly smeared with correspondingexperimental drugs twice a day for 14 days.Observe the wound healing of rats in each group after 5 d,8 d and14 d of treatment,calculate the wound healing rate of rats in each group and take the wound tissue of rats ineach group respectively,and analyze the expression of EGF,phosphorylated ERK1/2,IL-8 and PEG2 in thewound with immunohistochemical S-P method.ResultsThe wound healing rate of rats in G5 group,G4 group,G3 group,G2 group and G1 group increased in turn at 5 d,8 d and 14 d after wound treatment(all0.05).14days after surgery,IL-8 expression in rat wounds G2G5G4G3G1(G4G3G2 G1(all0.05).ConclusionCompoundseabuckthorn seed oil nano-emulsion can effectivelypromote wound healing after perianal abscess surgeryin rats,which may be related to the inflammatory基金项目：浙江省科技厅公益研究项目（LGF20H270001）；杭州市医药卫生科技项目（A20200122）1.杭州市第三人民医院（杭州 310009）2.杭州市中医院（杭州 310009）通信作者：杨关根,E-mail：实验研究667中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期肛门直肠周围软组织或其间隙发生急、慢性化脓性感染形成脓肿，称为肛周脓肿，其临床表现为不同程度的肛周局部红肿、灼热、疼痛等1-2。目前，肛周脓肿的主要治疗手段为脓肿切开引流术，但术后创面愈合缓慢，伤口疼痛，病程较长，容易形成肛瘘，给患者带来巨大的困扰和压力3-4。现代医学认为，创面修复过程存在一个极其复杂的信号网络调控机制，涉及组织、细胞、分子、基因等多个层面，任何一个环节的失控将会导致自身调节的紊乱。研究发现，白细胞介素-8（IL-8）、前列腺素 E2（PGE2）对术后创面炎症反应具有调节作用，表皮生长因子（EGF）是目前公认的与创伤愈合关系密切的细胞因子5。但其促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及作用机制是否与 EGF-细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路相关尚不明确。在长期的临床应用中，本研究团队发现复方沙棘籽油对肛周脓肿术后创面有其独特的疗效，可促进创面肉芽组织生长，效果显著，但其具体作用机制目前还没明确。本研究通过建立肛周脓肿大鼠术后创面模型，探讨复方沙棘籽油促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及其机制。1材料与方法1.1实验动物65 只 SD 大鼠，体质量（180依20）g，在 SPF 条件下饲养和实验，经医院动物伦理委员会批准同意。1.2主要的药品及试剂沙棘籽油（甘肃省格瑞斯生物科技有限公司），冰片（浙江华东医药有限公司），EGF、磷酸化 ERK1/2 抗体、过氧化物酶标记二抗及即用型 SABC 免疫组化试剂盒（中国武汉博士德公司）；检测试剂：抗 EGF 抗体（ab217366），抗ERK1+ERK2 抗体（ab17942）。1.3实验方法1.3.1复方沙棘籽油纳米乳化液制备低剂量组制备方法：取冰片 2.5 g，研细，加入沙棘籽油 10 g，搅拌使溶解，再加入乳化剂 16 g，搅匀，再加入蒸馏水，边加边搅拌，直至变成黏稠凝胶状，继续加入蒸馏水，使之呈透明或半透明状，并带淡蓝色乳光，最后加蒸馏水至 1 000 mL，搅匀，滤过，灌封，于 115.5益灭菌 30 min。高剂量组制备方法同上，最后加蒸馏水稀释至 500 mL。中剂量组介于二者之间。1.3.2动物模型的建立常规用碘伏消毒大鼠肛周皮肤，将 75%冰醋酸 0.05 mL 注射于大鼠肛门外周皮下，24 h 后肛门局部形成溃疡，伴有红肿、炎性渗出。参照局部症状四级评分标准（表 1）进行评分，4 分以下的大鼠剔出实验。动物模型的建立共选取65 只 SD 大鼠进行造模，实验结束按照评分标准，总分值在 4 分以上的大鼠共 53 只，为保证实验过程中干预措施的均衡性，最终选取 50 只模型 SD 大鼠进行实验。mediators of IL-8 and PEG2,and its activation of EGF-ERK pathway can promote the growth,proliferationand differentiation of wound keratinocytes and fibroblasts.Key words:Compound seabuckthorn seed oil;perianal abscess;wound healing；epidermal growth factor；extracellular signal-regulated kinase表 1局部症状四级评分标准0 分1 分2 分3 分红肿无勉强可见边缘高出皮肤红肿隆起逸1 mm，并超过溃面炎性渗出及溃疡无有炎性渗出，溃疡面约0.2 cm2炎性渗出，溃疡面 0.2耀0.3 cm2炎性渗出多，溃疡面跃0.3 cm2症状1.3.3实验分组及干预方法将 50 只模型大鼠称重后随机分为 5 组。从造模后第 1 天开始，各组涂抹相应的实验药物，2 次/d，两次用药间隔 4h，连续 14 d。按大鼠与人的体表面积换算关系及中药药理剂量设计 1颐2颐4 的方法换算大鼠用药剂量，见表 2。1.4观察指标1）创面愈合率：每天观察创面愈合情况，于术后 5、8、14 d 采用透明胶片描记测定局部创面面积，评价记录各组创面动态愈合率。2）术后14 d 创面 EGF、ERK1/2 表达情况：应用免疫组化S-P 法、通过 MIAS 医学图像分析管理系统分析EGF、ERK1/2 表达情况。3）术后 14 d 创面 IL-8、PGE2 表达情况：应用上述同样的方法检测各组创面磷酸化 IL-8、PGE2 表达水平。1.5统计学方法采用 SPSS 19.0 进行数据处理与分析，正态分布计量资料用 x依s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用检验，G4 组 G3 组G2 组 G1 组（均约0.05），见表 5，图 4、5。3讨论肛周脓肿术后创面恢复缓慢、伤口疼痛，病程长。如何加速术后创面修复及减轻痛苦是临床医师最需要解决的难题6-7。现代医学研究多侧重于新型高科技抗菌辅料、创面生长因子等，从生物细胞学领域寻求创面修复的突破8-10。同时运用外敷药物改善局部微循环并发挥抗菌抗炎作用，以达到术后创面愈合的目的11-12。但新型辅料在促进创面愈合及抗炎作用同时并不能减轻伤口疼痛，而创面生长因子也不具备抗炎及减轻疼痛的功效，因此寻求一种药物来促进术后创面修复，同时减轻疼痛，提高愈合质量，成为临床医生及患者共同关注的问题。多项研究表明沙棘籽油含有丰富的维生素 A、维生素E、氨基酸、黄酮、多酚等抗氧化成分，为组织重建提供营养物质，同时具有明显的生物活性作用，其抗感染能力强，促进创面愈合快13-14。同时本研究也发现冰片有散血止痛功效，能够改善术后疼痛及精神紧张焦虑导致的肛门括约肌痉挛。因此，本研究将两种药物组合成复方沙棘籽油，并通过纳米乳化技术，提高药物渗透、增大药物透皮速率和透皮量，维持恒定血药浓度。本研究结果显示，复方沙棘籽油纳米乳化液治疗组术后创面愈合率高于其余各组，提示复方沙棘籽油对术后创面愈合具有促进作用。免疫组化结果显示，复方沙棘籽油纳米乳化液治疗组大鼠创面组织中表皮生长速率均优于其他组，表明复方沙棘籽油有助于术后创面生长及愈合15。IL-8 可通过结合趋化因子受体 IL-8 受体 琢 和IL-8 受体 茁 对中性粒细胞产生趋化作用，从而实现对炎症反应的调节作用16-17。PGE2 是重要的细胞生长和调节因子，也是重要的疼痛递质，主要作用是扩张血管，同时具有免疫抑制和抗炎作用18-19。本研究显示：5 组大鼠术后 14 d 创面 IL-8 及 PEG2 表达水平差异均有统计学意义，说明其可能通过抑制炎症介质释放而改善创面疼痛。同时，EGF 是促进创面愈合的主要影响因素之一，对多种组织来源的上皮细胞有很强的促分裂活性，可促进上皮细胞、内表 45 组大鼠肛脓肿术后 14 d 创面组织 IL-8及 PEG2 表达水平比较组别例数（）IL-8PEG2G1 组106 758.81依2 103.5816 661.89依3 564.53G2 组10733.07依108.89a7 869.59依1 468.15aG3 组104 253.77依1 046.11b15 544.84依4 506.71bG4 组104 192.50依1 520.63b11 462.74依3 631.61bG5 组101 338.79依796.92b6 693.84依2 155.77b10.6115.6010.0010.012注：a与G1组比较，约0.05，b与G2组比较，约0.05图25组大鼠术后14d创面组织IL-8免疫组化表达（100）图35组大鼠术后14d创面组织PEG2免疫组化表达（100）表 55 组大鼠肛周脓肿术后 14 d 创面组织 EGF 及ERK1/2 表达水平比较组别例数（）EGFERK1/2G1 组104 077.43依785.8296.87依39.26G2 组102 113.28依894.44a11.73依8.47aG3 组102 399.90依1 663.80b92.74依60.99bG4 组10336.41依217.47b105.15依52.20bG5 组10362.66依192.59b450.86依221.50b34.55130.920约0.001约0.001注：a与G1组比较，约0.05；b与G2组比较，约0.05图45组大鼠术后14d创面组织EGF免疫组化表达（100）图5 5组大鼠术后14d创面组织ERK1/2免疫组化表达（100）670中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期皮细胞及成纤维细胞迁移20-21。EGF 还可促进肉芽组织形成，增加肉芽组织中 DNA、RNA、蛋白质及胶原合成，可促进血管形成及上皮再生，对皮肤损伤有较好的促愈合作用，是一类对创面修复有重要调控作用的多功能细胞因子。胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心，ERK 与EGF 在组织修复中的作用密切相关22。本研究显示：5 组大鼠术后 14 d 创面 EGF 及 ERK1/2 表达水平差异均有统计学意义，其中，G5、G4、G3、G2、G1 组大鼠术后创面 EGF 及 ERK1/2 表达水平依次降低（均约0.05），说明复方沙棘籽油纳米乳化液具有加速肛周脓肿术后创面修复作用，其可以通过促进创面 EGF 的表达寅EGF 激活 MAPK 途径寅ERK 磷酸化寅ERK 通路被激活寅促进创面角质形成细胞、成纤维细胞生长、增殖、分化寅促进创面愈合，此通路通过介导角质形成细胞、成纤维细胞的增殖与迁移活动促进肉芽组织生长，最终可导致迅速上皮化从而使创面愈合23。综上所述，复方沙棘籽油纳米乳化液可能通过IL-8 及 PEG2 抑制炎症介质释放，通过 EGF-ERK通路的调控达到促进患者术后创面修复的作用，这表明复方沙棘籽油纳米乳化液对肛周脓肿术后创面具有潜在的治疗价值。参考文献：1柳春生,李积良,王继宁.肛痈促愈汤在促进肛周脓肿术后创面愈合的作用及对血管内皮因子的影响 J.中华中医药学刊,2020,38(12):205-208.2黄方军,刘阳,潘敏,等.一次性切开根治术与传统切开引流术治疗肛周脓肿的疗效比较J.安徽医学,2020,41(4):470-472.3Chen XX,Tang QZ,Luo HB,et al.Intervention effect ofevidence-based nursing on postoperative recovery of vacuumsealing drainage in patients with high perianal abscess withmagnetic resonance imaging sequence images J.Comput IntellNeurosci,2022,2022:1405134.4韩林,孙艳军,孙登群.龙血竭促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及机制J.辽宁中医杂志,2022,49(2):101-104,222.5Ghahramani L,Minaie MR,Arasteh P,et al.Antibiotic therapy forprevention of fistula in-ano after incision and drainage of simpleperianal abscess:a randomized single blind clinical trial J.Surgery,2017,162(5):1017-1025.6邹世镇,王炜,陈德伦.肛周脓肿术后创面愈加速合方法的研究进展J.结直肠肛门外科,2018,24(5):523-527.7雷倩,沙静涛.消肿促愈汤溻渍促进肛周脓肿术后创面愈合及对血清超敏 C 反应蛋白、白细胞介素 6 水平的影响J.河北中医,2020,42(4):554-557.8谭倩,赵鑫,陈贝,等.生长因子在创面愈合中的作用研究进展J.山东医药,2019,59(4)：106-110.9Zhao X,Guo B,Wu H,et al.Injectable antibacterial 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