分子生物学实验室常用仪器设备简介精.doc

实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介
实验室主要仪器，设备的简介及使用方法
微量移液器
微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。
微量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调节读数。移液器常见的四种规格分别是：
0.5～10μl(读数窗显示0.5～10.0,每转1档为0.1μl);
10～100μl(读数窗显示10.0～100, 每转1档为1μl);
20～200μl(读数窗显示20～200, 每转1档1μl);
100～1000μl(读数窗显示100～1000, 每转1档为5μl).
   量液的操作步骤：
1． 将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）
2． 将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；
3． 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；
4． 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；
5． 等一秒钟后将吸嘴提离液面
6． 平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；
7． 提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
量液操作注意问题：
1． 未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。
2． 一定要在允许量程范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。
3． 不要横放带有残余液体吸嘴的移液器。
4． 不要用大量程的移液器移取小体积样品。
5. 移液器使用完后，将刻度调到最大刻度，收藏。
低温台式高速离心机
离心机的分类
低速：每分钟几千转
高速：每分钟1 ~ 3万转
超速：每分钟3万转以上
离心机的功能： 分离，纯化
低速：细胞等大分子
高速：DNA，蛋白等
超速:  病毒，蛋白等，根据用途又可分为分析超速离心 机和制备超速离心机。
低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段
基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术
本实验室所用离心机为台式高速离心机（IBM），配有角式转头：24×1.5ml；极限转速20000rpm
台式高速离心机使用步骤
1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。
2、打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡，完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。
3、关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。
4、插上电源插座，按下电源开关（电源开关在离心机背面，电源座上方）。
5、设置转子号、转速、时间：
在停止状态下时，用户可以设置转子号、转速、时间，此时离心机处于设置状态，停止灯亮、运行灯闪烁；按下启动离心开始（常用，最高转速为13000r/min，时间最长为20分钟）；
注意：对应的转子一定要设置在相应的转速范围内，不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。
6、离心机时间倒计时到“0”时，离心机将自动停止，当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。
注意事项：
1、离心机在运转时，不得移动离心机，不要打开门盖。
2、安放离心机的台面应坚实平整，四只橡胶机脚都应与台面接触和均匀受力，以免产生振动。
3、离心前，离心管加液要平衡，若加液差异过大运转时会产生大的振动，此时应停机检查，使加液符合要求，离心试管必须成偶数对称放入。
4、若运转时有离心试管破裂，会引起较大振动应立即停机处理。
5、离心机彻底停止后，才可开盖，取样
恒温气浴摇床
使用及性能：
摇床（振荡器）为实验室的常规设备。广泛用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生物化学反应以及酶和组织研究等。实验室常用的液体摇匀，微生物、细菌和细胞培养。
SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，采用微电脑控制系统，温度范围：室温＋5℃～60℃，精度±0.5℃；时间范围：1分钟～99小时59分钟；转速范围：60RPM～250RPM
操作程序：
1）样品瓶牢固放入弹簧夹中
2）接通电源开关，仪器进入准备状态
3）参数设定，（设定温度、时间、转速等参数 ）
4） 按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转；
5）按下控制面板的电源键两秒，显示屏显示消失，关闭电源总开关
超净工作台
使用及性能：
超净工作台为分子生物学无菌操作提供可能，分为垂直送风和水平送风两种。
超净台由三相电机作鼓风动力，功率145～260W左右，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过程中不受污染。
操作程序：
1）使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。
2）接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
3）工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
4）操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
5）最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。
注意事项：
操作时一定注意关掉紫外，防止对实验人员造成伤害
灭菌锅
使用及性能：
细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的试剂、器皿及实验用具，应严格灭菌；应将实验器械，试剂等进行高压消毒。对于经过导入DNA重组分子的菌株，操作后必须进行严格的高压消毒灭活处理 ；大批实验物品、试剂、培养基等可以使用大型消毒器进行消毒。一些不能经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）浸泡消毒。所有的细胞培养、细菌培养的操作，都应在紫外线消毒后的超净工作台中进行
操作程序：
1）开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没至板上
2）通电：将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮
3）堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果 ，灭菌时间： 121℃， 20min，；如为液体，液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中，且不可装满，2/3即可， 121℃， 18-20min
3）密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧
4）设定时间和温度，开始灭菌
5）灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气
注意事项：
如是手动的灭菌锅，在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。
要等温度降为“0”，才可打开灭菌锅锅盖；
由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。
PCR仪
PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行DNA变性、引物复性、DNA聚合酶催化的延伸反应的三个过程
PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学等等
操作步骤
1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”,显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单
准备执行程序。
2、放入样品管，关紧盖子。
3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》， 用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示
按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。
4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》，
1）命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。
2）输入程序步骤：名字输入后，确认，然后输入相关程序
5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。
6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。
用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
如何设置一个PCR程序：
一般分为8步：
1、预变性：可用94～95℃，2～10min,一般用 5min。
2、变性：一般用95℃，30s~2min,一般 45s~1min。
3、退火：温度自定，30s~2min。
4、延伸：72℃，对于〈1kb=1min,每增加 1kb加1min。
5、循环数：一般25～35个循环(2,3,4步循环）。
6、最终延伸：72℃，5～15min。
7、保存：4℃，时间设为0。
8、END。
电泳仪
电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要分析手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳
应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备。
实验室所用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）
操作程序：
1． 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。
2．按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。
3．确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）
4．电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣
注意事项
1． 电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。
2． 仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。
3． 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
4.使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。
作业
列出分子生物学常用仪器的名称，用途及操作时的注意事项。
一，微量移液器
微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。
量液操作注意问题
1． 未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。
2． 一定要在允许量程范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。
3． 不要横放带有残余液体吸嘴的移液器。
4． 不要用大量程的移液器移取小体积样品。
5. 移液器使用完后，将刻度调到最大刻度，收藏。
二，离心机的功能： 分离，纯化
注意事项：
1、离心机在运转时，不得移动离心机，不要打开门盖。
2、安放离心机的台面应坚实平整，四只橡胶机脚都应与台面接触和均匀受力，以免产生振动。
3、离心前，离心管加液要平衡，若加液差异过大运转时会产生大的振动，此时应停机检查，使加液符合要求，离心试管必须成偶数对称放入。
4、若运转时有离心试管破裂，会引起较大振动应立即停机处理。
5、离心机彻底停止后，才可开盖，取样
三，恒温气浴摇床
使用及性能：
摇床（振荡器）为实验室的常规设备。广泛用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生物化学反应以及酶和组织研究等。实验室常用的液体摇匀，微生物、细菌和细胞培养。
四超净工作台
使用及性能：
超净工作台为分子生物学无菌操作提供可能，分为垂直送风和水平送风两种。
注意事项：
操作时一定注意关掉紫外，防止对实验人员造成伤害
五．灭菌锅
使用及性能：
细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的试剂、器皿及实验用具，应严格灭菌；应将实验器械，试剂等进行高压消毒
注意事项：
如是手动的灭菌锅，在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。
要等温度降为“0”，才可打开灭菌锅锅盖；
由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。
六．PCR仪
PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行DNA变性、引物复性、DNA聚合酶催化的延伸反应的三个过程
PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学等等
七．电泳仪
电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要分析手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳
注意事项
1． 电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。
2． 仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。
3． 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
4.使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。

实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;
学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1)DNA分子大小       
迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）
2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
   Agarose：  0.5%：  1-30 kb；       
          0.7%：  0.8-12 kb
1.2%：  0.4-7 kb；            
     1.5%：  0.2-3 kb.
3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃
6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)
7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA  pH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。
仪器和试剂
仪器
微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉
试剂
琼脂糖：1.0%；
电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）
操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1XTAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；
c.将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。
（2）点样
用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。
（4）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
实验结果及分析

实验结果不是很理想，可能的原因是小组间的点样间隔时间太长以至于样品扩散造成结果的不理想另一个人原因是点样没有到位造成的，第二种原因的可能性大一点。
作业
做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题。
答：1，溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染
制琼脂糖凝胶时在特定的操作区操作。
2，微波炉加热使琼脂完全溶解要防止过热溢出三角瓶，要在瓶上加一张纸。
3，制胶时插入适当的梳子，当琼脂糖冷却凝固后，要小心垂直向上拔出梳子，小心样孔被弄破
4，点样时，要把样品点入点样孔下部，电泳时条带平整明亮。
5，要正确使用微量移液器，等器材视点用后的结果不致出现错误。