生物信息学作业.doc

乳腺癌易感基因BRCA1的研究
班级：5061专业：药剂学 姓名：孙建梅

一、实验目的:
（1）掌握中文文献全文的检索和获得方法。
（2）掌握Pubmed数据库文献的检索和交大图书馆英文数据库全文的获得方法。
（3）掌握核酸序列搜索的方法。
（4）掌握核酸序列相似性分析的方法。
（5）掌握PCR引物设计软件的原理、使用及特点。
（6）掌握蛋白质序列搜索的方法。
（7）掌握蛋白质序列分析常用软件的使用方法。
二、研究背景:
乳腺癌易感基因(BRCA1)的突变率与35%～40%的家族性乳腺癌和卵巢癌有关。该基因常以染色体显性方式遗传,并有很高的外显率。外显率在乳腺癌为60%~80%,卵巢癌也可达15%~40%。该基因作为一种抑癌基因, 不仅能抑制细胞生长, 还参与细胞周期调控、基因转录调节、DNA 损伤修复及其凋亡等重要细胞活动, 在维持基因稳定性中起重要作用。BRCA1是目前所发现的最重要的乳腺癌易感基因之一，本人选择其为研究对象。
三、实验方法、步骤及结果:
1．在中国知网（CNKI）中查找中文文献：

2．在PubMed中查找英文文献：

3 在Genbank中查找BRCA1基因及其序列：
登陆NCBI主页，网址：http://.ncbi.nlm.nih.gov/guide/，选择gene数据库

4. 使用NCBI网站中的BLAST工具进行序列比对
登陆http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，选择核酸序列比对nucleotide BLAST，界面显示如下,

输入登录号，NM-007294.3，点击“BLAST”。结果如下：

与其匹配的核苷酸序列和基因组序列如下：

一条核苷酸序列为“Homo sapiens breast cancer 1（BRCA1）, transcript variant 1, mRNA”，登录号：NM_007294.3。
另一条核苷酸序列为“Homo sapiens breast cancer 1（BRCA1）, transcript variant 2, mRNA”，登录号：NM_007300.3。

5．蛋白质序列的比对
检索页面：

结果输出：

6. 根据序列，设计PCR引物：
（1）利用peimer3进行引物设计
登陆引物设计软件primer3网址http://frodo.wi.mit.edu/primer3/。输入FASTA格式的核苷酸序列，运算得到：
上游引物：5’caccctctgctctgggtaaa 3’
下游引物：5’aagctcattcttggggtcct 3’
产物：5680bp。

引物与模板结合的位点显示如下：

7．蛋白质预测
BRCA1蛋白在NCBI protein数据库中的登录号为NP-009225.3，共1863个氨基
酸残基组成。
（1）使用protparam在线软件分析蛋白质基本理化性质。结果如下，分子量：207720.8，理论等电点：5.29，为近似不稳定蛋白，亲水。

（2）跨膜区序列和方向预测：
http://.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html，结果如下，分析显示该蛋白没有跨膜区。

（3）使用SignalP（http://.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽切割位点。神经网络及隐氏马尔可夫模型均认为该蛋白为非分泌性蛋白，无信号肽位点。

（4）使用sopma软件预测蛋白质的二级结构：

该蛋白二级结构以为a螺旋为主，还包括随意卷曲和β折叠。
（5）使用PDB http://.rcsb.org/pdb/search/advSearch.do?st=SequenceQuery，预测蛋白质三级结构及功能，没有找到匹配结构。

四、分析与讨论:
近年来，BRCA1的研究越来越广泛。BRCA1基因覆盖大约100 k b的基因组DNA, 含有24个外显子, 其中22个为编码的外显子。BRCA1基因编码1863个氨基酸, 与已知蛋白的同源性较低。
在Genbank中查找BRCA1基因，得到对该基因的概述：BRCA1基因能够编码一种在维持基因组稳定性中起作用的核蛋，它也被视为一种肿瘤抑制基因。其编码的蛋白质结合其他肿瘤抑制基因，DNA损伤传感器及信号转导形成一个大的多亚基蛋白复合物称为相关基因组监控复杂的BRCA1（BASC），该基因产物与RNA聚合酶II结合，并通过C端结构域，与组蛋白去乙酰化酶复合物相互作用。这种蛋白在转录、核酸修复、双链断裂和重组中发挥了作用。该基因突变约40%导致遗传性乳腺癌，而高达80%以上则会导致遗传性乳腺癌和卵巢癌。选择性剪接在调节该基因的亚细胞定位和生理功能中起着调节作用。许多剪接体的变体并未被描述，但是其中一些与基因突变导致的疾病相关的变体的全长序列已被描述。位于17号染色体上相关假基因也已被确定。
BRCA1基因mRNA在NCBI数据库中的登录号为NM-007294.3，BRCA1蛋白在NCBI protein数据库中的登录号为NP-009225.3，共1863个氨基酸残基组成。在进行核酸及蛋白质序列比对过程中，发现了若干条核苷酸序列和基因组序列和其匹配。
根据序列，设计PCR引物，可得上游引物：5’caccctctgctctgggtaaa 3’，下游引物：5’aagctcattcttggggtcct 3’，产物：5680bp以及上、下游引物与模板结合的位点。
蛋白质预测中，可得到以下结论：
1、 BRCA1蛋白在NCBI protein数据库中的登录号为NP-009225.3，1863个氨基
酸残基组成。使用protparam在线软件分析蛋白质基本理化性质。结果如下，分子量：207720.8，理论等电点：5.29，为近似不稳定蛋白，亲水。
2、跨膜区序列和方向预测：结果分析显示该蛋白没有跨膜区。
3、预测信号肽切割位点，结果显示神经网络及隐氏马尔可夫模型均认为该蛋白为非分泌性蛋白，无信号肽位点。
4、蛋白质二级结构预测认为该蛋白二级结构以a螺旋为主，还包括随意卷曲和β折叠。
5、预测蛋白质三级结构及功能，没有找到匹配结构。
总之，关于BRCA1 的研究已经取得了较大进展, 如BRCA1 在转录调节及DNA 修复中的作用已经被肯定。BRCA1 基因异常还在人类许多癌症中被证实,
包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、子宫内膜癌等。但是有关BRCA1 的抑癌机制, 如何提高基因的检测率以及怎样对基因突变携带者进行有效的预防
等问题, 仍需更加深入和系统地进行研究。
五、参考文献
[1]严景华,叶棋浓,黄翠芬. 乳腺癌易感基因BRCA1研究进展[J]. 遗传,2004,03:367-372.
[2]崔珅,韩世愈,林英姬. 乳腺癌易感基因(BRCA1)研究进展[J]. 中国肿瘤,2008,04:290-292.
[3]王曦,杨名添,曾益新. 乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变检测及其临床意义[J]. 国外医学(肿瘤学分册),2001,01:63-65.
[4]Daley, J.M.; Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the choice between rebination and
end joining at DNA double-strand breaks. Mol.Cell Biol., 2014, 34(8), 1380-1388.
[5] Zhu, Q.; Pao, G.M.; Huynh, A.M.; Suh, H.; Tonnu, N.; Nederlof,P.M.; Gage, F.H.; Verma, I.M. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature, 2011, 477(7363),179-184.
[6] Kurian, A.W. BRCA1 and BRCA2 mutations across race and ethnicity: distribution and clinical implications. Curr. Opin. Obstet.Gynecol., 2010, 22(1), 72-78.