微生物生理生化实验.doc

【实验题目】
微生物生理生化实验
【实验目的】
1. 了解生理生化的意义。
2. 掌握几种常用生理生化的实验方法。

【实验器材】
1、 菌种：
枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，变形杆菌，产气肠杆菌
2、试剂： 
卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等
3、 仪器和用具： 
酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 等
4、 培养基
淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验）
葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验）
蛋白胨水培养基（吲哚实验）
葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红培养基）

【实验原理】
在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以促进细胞外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。具体实验原理如下：
一、 大分子物质的水解实验原理
1、淀粉水解
由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，所以必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精,双糖和单糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。已知淀粉遇到碘会显现蓝色，因此可通过在淀粉培养基上滴加碘液来判断微生物是否能产生淀粉酶分解淀粉，菌落周围不呈蓝色，出现无色透明圈，则该菌种能够水解淀粉。
2、油脂水解
脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸，而产生的脂肪酸可改变培养基的PH,因此在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后可通过观察菌苔的颜色判断菌种是否能够水解油脂，若出现红色斑点，则说明这种菌可产生分解油脂的酶。
二、 糖发酵实验原理
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

A 培养前的情况

B 培养后 产酸不产气

C 培养后 产酸产气

图1：糖发酵实验
三、 IMViC实验
1、 吲哚实验
用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
2、 甲基红实验
某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸、乙酸和乳酸等多种有机酸，使培养基的PH值降低，加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但是这个实验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上还是有价值的。这两种细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性（PH4),而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等，使PH升至6左右。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

【实验内容及步骤】
1、淀粉水解实验 
（1）倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，
在酒精灯火焰旁倒平板，每组两个平板。  
（2）标记：用记号笔在平板底部划成四部分，标好要进行接种的菌的编号，以免混淆。 
（3）接种：在无菌操作台上，将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别在
标记好的区域内点种，如图1所示，注意仅用接种针接触极少面积的培养基，避
免因接种菌量过多而造成假阳性。  
（4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。  
（5）观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入适量卢戈氏碘液于
平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否
有无色透明圈产生，若有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，该种菌为阳性，
反之则为阴性。记录实验结果。

2、油脂水解试验
（1）倒平板：按照油脂培养基配方配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，
充分振荡，使油脂均匀分布，在酒精灯火焰旁倒平板，每组两个平板。  
（2）标记：用记号笔在在平板底部划成四部分，并标好需要接种的菌的编号。
（3）接种：在无菌操作台上将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别划十
字线接种于平板相对应部分的中心，如图2所示。  
（4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。 
（5）观察：取出平板，观察菌苔颜色，如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。记录
实验结果。
3. 葡萄糖发酵实验 
（1） 培养基的配制：按照糖发酵培养基配置葡萄糖发酵培养基，分装至试管中，先将德汉氏
小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空
气，每组3只试管，灭菌。 
（2） 接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管2支分别接
入大肠杆菌和普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气
泡，第3支不接种，作为对照组。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵
培养基的名称和所接种的细菌菌名。  
（3） 培养：把接种后的试管在试管架上放好，将其放入培养箱中于28℃下培养两天。 
（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
4. 乳糖发酵实验
（1） 培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往
德汉氏小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中
进入空气，每组五只试管，灭菌。 
（2） 接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管2支分别接入
大肠杆菌和普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。在
试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。  
（3） 培养：把接种后的试管在试管架上放好，将其放入培养箱中于28℃下培养两天。 
（4） 观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
5. 吲哚实验
（1） 培养基的配制：按照蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组3只，高压
灭菌锅灭菌
（2） 接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨
水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。 
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上放好，将其放入培养箱中于28℃下培养两天。 
（4）观察：往培养后的蛋白胨水培养基内加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚
上升后，沿试管避徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性
反应。观察加入试剂后试管内的颜色反应并记录实验结果。
6. 甲基红实验
（1） 培养基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组3只
试管 ，高压灭菌锅灭菌。
（2） 接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖
蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。 
（3） 培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养
两天。 
（4） 观察：培养两天后后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培
养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实验结果。

【实验结果】
表1.淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
菌种
阴/阳性
结论
大肠杆菌
-
不可以水解淀粉
枯草芽孢杆菌
+
可以水解淀粉
普通变形杆菌
-
不可以水解淀粉
铜绿假单胞菌
-
不可以水解淀粉

表2. 油脂水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
菌种
阴/阳性
结论
大肠杆菌
-
不可以水解油脂
枯草芽孢杆菌
-
不可以水解油脂
普通变形杆菌
-
不可以水解油脂
铜绿假单胞菌
+
可以水解油脂
表3. 葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
样品
大肠杆菌
普通变形杆菌
空白
颜色
黄色
黄色
紫色
是否产气
是
是
否
阴/阳性
+
+
-
结论
大肠杆菌能分解葡萄糖，同时产酸产气
普通变形杆菌能分解葡萄糖，同时产酸产气
对照组
表4. 乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
样品
大肠杆菌
普通变形杆菌
空白
颜色
黄色
紫色
紫色
是否产气
是
否
否
阴/阳性
+
-
-
结论
大肠杆菌能分解乳糖，同时产酸产气
普通变形杆菌不能分解乳糖
对照组

表5.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
样品
大肠杆菌
产气肠杆菌
是否产生红色环状物
是
否
阴/阳性
+
-
结论
大肠杆菌可以分解色氨酸生成吲哚
产气肠杆菌不能分解色氨酸生成吲哚
表6. 甲基红试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
样品
大肠杆菌
产气肠杆菌
颜色
变红
变黄
阴/阳性
+
-
结论
大肠杆菌在培养期仍维持酸性PH
产气肠杆菌将有机酸转化为非酸性末端产物

【实验小结】
本次实验的内容包括：
用淀粉培养基对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和普通变形杆菌进行培养，并用卢戈氏碘液检验菌种是否具有产生淀粉酶，利用淀粉的能力；
‚再用油脂培养基对这四种菌进行培养，用中性红指示剂检验其是否会产生脂肪酶；
ƒ用糖发酵培养基对大肠杆菌和普通变形杆菌进行培养，利用1.6%溴甲酚紫乙醇溶液和德汉氏小管检验其是否能利用糖产酸产气；
④用蛋白胨水培养基培养培养大肠杆菌和产气肠杆菌，用乙醚和吲哚检验其能否产生色氨酸；
⑤用葡萄糖蛋白胨水培养基培养基培养大肠杆菌和产气肠杆菌，用甲基红指示剂检验其能否利用葡萄糖产有机酸。
实验内容较多，且用到的试管，平板和菌种较多，因此实验中要及时贴好标签，做好标记，以免混淆。同时，通过这次实验掌握了几种常用的生理生化实验方法，相信对以后的实验会有很大帮助，并掌握了多种培养基制备的方法以及点种与十字接种两种接种方法：点种时接种面积要小，使菌在小范围内生长，以便于观察；十字接种时尽量将菌接种在该部分的中央区域，在本次实验进行十字接种时，由于划线时没有看清接种环和培养基之间的距离，导致将固体培养基表面划破，在今后的实验中，要在接种操作时更小心仔细些。

【思考与讨论】
1、 你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要触及高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。实验中菌苔周围出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2、 不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解后产生葡萄糖，因此可以用斐林试剂验证淀粉是否被分解。呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性则说明淀粉未被水解。
3、 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵实验应该出现什么结果？
答：有氧代谢葡萄糖产生CO2，但CO2微溶于水且碳酸酸性较弱，因此试管中颜色不变化，仍为紫色。但由于产生了CO2，因此德汉氏小管中有气柱。
4、 讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5、 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性的指示剂进行区分。同时吲哚能通过有明显颜色变化的化学反应观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用是否有吲哚产生作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸。
6、 为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性,而产气肠杆菌为阴性？
答：当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
【附录】培养基配方
一、淀粉培养基
蛋白胨
10g
NaCl
5g
牛肉膏
5g
可溶性淀粉
2g
蒸馏水
1000ml
琼脂
15-20g
121℃灭菌20min.
二、 油脂培养基
蛋白胨
10g
牛肉膏
5g
NaCl
5g
香油或花生油
10g
1.6％中性红水溶液
1ml
琼脂
15-20ml
蒸馏水
1000ml
PH
7.2
121S℃灭菌20min
注：1、不能使用变质油。
2、油和琼脂及水先加热。
3、调好PH后，在加入中性红。
4、分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
三、 葡萄糖发酵培养基
蛋白胨水培养基
1000ml
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
1-2ml
葡萄糖
12.5g
PH
7.6
110℃灭菌30min
四、 乳糖发酵培养基
蛋白胨水培养基
1000ml
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
1-2ml
乳糖
12.5g
PH
7.6
110℃灭菌30min
五、 蛋白胨水培养基
蛋白胨
10g
NaCl
5g
蒸馏水
1000ml
PH
7.6
121℃灭菌20min
六、 葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨
5g
葡萄糖
5g
K2HPO4
2g
蒸馏水
1000ml
PH
7.0-7.2
分装试管，每管10ml,112℃灭菌30min