蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响.pdf

刘俊财，葛珍，江晓，等.蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响 J.食品工业科技，2023，44（21）：395401.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010021LIUJuncai,GEZhen,JIANGXiao,etal.EffectsofRoyalJellyPeptideonMotorAbilityandGeneExpressioninZebrafishModelofAlzheimersDiseaseJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(21):395401.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010021 营养与保健 蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响能力与关键基因表达影响刘俊财1，葛珍1，江晓2,*，崔保金3，张平3，孙建安1,*，毛相朝1（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003；2.青岛滨海学院医学院，山东青岛266404；3.山东丰采健康产业有限公司，山东潍坊262612）摘要：目的：探究蜂王浆酶解产物（蜂王浆肽）对阿尔茨海默症（Alzheimersdisease，AD）模型斑马鱼的影响。方法：将150 尾（4dpf）的野生型AB 品系斑马鱼随机分为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐阳性对照组（3.33g/mL）、蜂王浆酶解液冻干粉-1 组（LPR-1，1000g/mL）和蜂王浆酶解液冻干粉-2 组（LPR-2，1000g/mL），于 6 孔板中进行实验，每孔容量为 3mL，每组 30 尾。除正常组外，其它组斑马鱼采用水溶给予六水氯化铝（180mol/L）方法建立 AD 斑马鱼模型。各实验组同时给予相应药物处理 24h 后，对其运动功能障碍恢复功效、反应能力改善功效、乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制功效与脑凋亡抑制功效进行评价，同时计算 TNF-、caspase-3 和 BDNF 基因的相对表达量，分析其对相关基因的影响。结果：LPR-1、LPR-2 给药组和模型对照组比较，斑马鱼总运动距离延长（高度显著，P0.01），每分钟光暗运动速度差值与 BDNF 基因相对表达量极显著提升（P0.001）；乙酰胆碱酯酶（AchE）荧光值（极显著，P0.001）与脑部凋亡细胞荧光强度（高度显著，P0.01）下降，TNF-基因相对表达量（高度显著，P0.01）与 caspase-3 基因相对表达量（显著，P0.05）降低。结论：LPR-1 和 LPR-2 均具有防治阿尔茨海默症功效，具有在防治阿尔茨海默症功能食品开发中的应用潜力。关键词：蜂王浆肽，斑马鱼，阿尔茨海默症，行为学分析，运动功能障碍，乙酰胆碱酯酶，脑凋亡，基因相对表达量本文网刊:中图分类号：TS201.4文献标识码：A文章编号：10020306（2023）21039507DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023010021EffectsofRoyalJellyPeptideonMotorAbilityandGeneExpressioninZebrafishModelofAlzheimersDiseaseLIUJuncai1，GEZhen1，JIANGXiao2,*，CUIBaojin3，ZHANGPing3，SUNJianan1,*，MAOXiangzhao1（1.CollegeofFoodScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China；2.CollegeofMedical,QingdaoBinhaiUniversity,Qingdao266404,China；3.ShandongFengcaiHealthIndustryCo.,Ltd.,Weifang262612,China）Abstract：Objective:Investigationofthetraitimprovementimpactofroyaljellyenzymaticproducts(royaljellypeptides)onAlzheimersdisease(AD)modelzebrafishes.Methods:150wild-typeABstrainzebrafishes(4daysafterfertilization,4dpf)wererandomlydividedintonormalgroup,modelcontrolgroup,donepezilhydrochloridepositivecontrolgroup(3.33g/mL),royaljellyenzymaticdigestlyophilizedpowder-1group(LPR-1,1000g/mL)androyaljellyenzymatic收稿日期：20230104基金项目：山东省新旧动能转换重大产业攻关项目（202153）。作者简介：刘俊财（1997），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：。*通信作者：江晓（1984），女，硕士，讲师，研究方向：功能食品开发与活性研究，E-mail：jx99-0-。孙建安（1984），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术与海洋生化工程，E-mail：。第44卷第21期食品工业科技Vol.44No.212023年11月ScienceandTechnologyofFoodIndustryNov.2023digestlyophilizedpowder-2group(LPR-2,1000g/mL),andthesegroupswereaddedin6-wellplates,respectively.Thevolumeofeachwellwas3mL,and30tailsofzebrafisheswereemployedineachgroup.Exceptforthenormalgroup,zebrafishesinothergroupsweretreatedwithaluminumchloridehexahydrate(180mol/L)toestablishADmodels.Theefficacyofrecoveryofmotordysfunction,improvementofresponsiveness,inhibitionofacetylcholinesterase(AchE)andinhibitionofapoptosiswereevaluatedforeachexperimentalgroupaftertreatedwithcorrespondingdrugssimultaneouslyfor24h.TherelativeexpressionsofTNF-,caspase-3andBDNFgeneswerealsocalculatedandtheireffectsonrelatedgenes were analyzed.Results:Compared to the model control group,the LPR-1 and LPR-2 administration groupszebrafishesshowedprolongedtotallocomotordistance(highlysignificant,P0.01),thedifferentialspeedoflightanddarkmotion per minute(P0.001)and the relative expression of BDNF gene(P0.001)were significantly increased.Acetylcholinesterase(AchE)fluorescencevalues(extremelysignificant,P0.001)andbrainapoptoticcellfluorescenceintensity(highly significant,P0.01)were decreased,and the relative expression of TNF-gene(highly significant,P0.01)andcaspase-3gene(significant,P0.05)werealsodecreased.Conclusion:BothofLPR-1andLPR-2haveanti-Alzheimersdiseaseefficacy,andhavepotentialforthedevelopmentoffunctionalfoodsforthepreventionortreatmentofAlzheimersdisease.Key words：royal jelly peptide；zebrafish；Alzheimers disease；behavioral analysis；motor dysfunction；acetylcholin-esterase；brainapoptosis；relativegeneexpression阿尔茨海默症（Alzheimersdisease，AD）又称老年痴呆症，是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病1。以记忆力下降和认知功能障碍为特征的复杂的多因素慢性进行性精神衰退疾病2，临床表现为进行性记忆和认知能力减退3、语言障碍、精神运动异常等症状。患者早期以近记忆下降为主，疾病后期远期记忆也受累及，日常生活受到影响，表现为学习新知识困难，工作主动性下降，承担新任务无法胜任，并随时间推移而加重，伴有语言障碍、计算障碍，视空间障碍，丧失日常技能，失去认知能力，最终导致大部分脑部和身体组织器官受损甚至死亡45。阿尔茨海默症发病原因及发病机理非常复杂，目前仍未阐明6，尚无特效的治疗药物。蜂王浆作为一种多领域认知增强剂，可以恢复阿尔茨海默症模型的认知功能障碍7，蜂王浆的提取物能显著地提高神经干细胞向神经元、星状细胞和胶质细胞的分化，是一种对大脑具有神经营养和神经保护作用的食品。其作用机制可能与以下几个方面有关：促进神经保护系统相关神经元的转录和免疫反应活性，增强海马神经元生长抑素基因的表达8；降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平9，增强神经元的代谢活动，减少阿尔茨海默症发病机制中有毒的-淀粉样蛋白（A）水平，减轻神经退行性变和氧化应激水平，并增加海马区新神经元的增殖1012。目前的研究大多聚焦于蜂王浆原料对阿尔茨海默症功能的研究，蜂王浆是蜂王的主要食物，由水、蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物质等组成的乳液体系，营养丰富，蛋白质占比达 15%，它有助于提升蜂王的繁殖力，可以有效促进神经保护系统相关神经元的转录和免疫反应活性，但蜂王浆味酸，口感涩，质地粘稠且不易保存，制约了其发展，蜂王浆酶解为多肽后可以改善其不良风味，增加稳定性，更加方便贮藏运输，但是否具有防治阿尔茨海默症功效值得探究。蜂王浆组成复杂，发挥功效成分不明确，酶解后制备成肽测定其活性功能更有助于明确其作用组分。研究表明，将原料蛋白酶解为多肽后，也有明显的防治阿尔茨海默症功效13。本文以蜂王浆酶解产物（蜂王浆肽）为样品，六水氯化铝建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，探讨蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼的影响，为蜂王浆类防治阿尔茨海默症功能产品的开发提供数据支持。1材料与方法1.1材料与仪器蜂王浆山东丰采健康产业有限公司；蜂王浆酶解液冻干粉-1（LPR-1）、蜂王浆酶解液冻干粉-2（LPR-2）实验室自制；酸性蛋白酶南宁庞博生物工程有限公司，100000U/g；野生型 AB 品系斑马鱼杭州环特杭州环特生物科技股份有限公司；黑色素等位基因突变 Albino 品系斑马鱼杭州环特杭州环特生物科技股份有限公司；盐酸多奈哌齐加拿大 TRC 公司；六水氯化铝上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）Sigma 公司；吖啶橙上海麦克林生化科技有限公司；乙酰胆碱酯酶检测试剂盒AATBioquest 公司；甲基纤维素上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNA 快速提取试剂盒上海奕杉生物；第一链合成试剂盒天根生化科技（北京）有限公司。SZX7 解剖显微镜OLYMPUS 公司；VertA1-CCD 相机上海土森视觉科技有限公司；AZ100 电动聚焦连续变倍荧光显微镜Nikon 公司；ZebraLab3.22 行为分析仪ViewPoint 公司；SPARK 多功能酶标仪TECAN 公司；CFX96 荧光定量 PCR仪BIO-RAD 公司；BE-6100 微孔板迷你离心机海门市其林贝尔仪器制造有限公司；OSE-Y30 高速组织研磨器天根生化科技（北京）有限公司。1.2实验方法1.2.1LPR-1 与 LPR-2 的制备称取一定量的蜂王396食品工业科技2023 年11月浆，在料液比（蜂王浆:水）1:4（g/mL），初始 pH 为 5，酶解温度为 45，加酶量 9000U/g 时使用酸性蛋白酶酶解 5h；在料液比（蜂王浆:水）为 1:4（g/mL），酶解温度为 55，加酶量为 10000U/g 时使用酸性蛋白酶酶解 4h，酶解结束后沸水浴 10min，8000r/min 离心 20min 后取上清冷冻干燥待用。分别将上述酶解液冻干粉配制成 200mg/mL 溶液，过膜后经葡聚糖凝胶 G-15 层析分离，超纯水洗脱，洗脱条件：流速 3.5mL/min，上样量为 1mL。在上述两种酶解条件，相同洗脱条件下洗脱，在第一种酶解条件下，收集 18002700s 的洗脱峰，命名为 LPR-1，在第二种酶解条件下，收集 29004400s 的洗脱峰，命名为 LPR-2。1.2.2最小中毒浓度（minimumtoxicconcentration，MTC）测定LPR-1，LPR-2 分别用标准稀释水配制成 20.0mg/mL 的母液，分装后20 储存。盐酸多奈哌齐1415用 DMSO 配制成 3.33mg/mL 母液，20 储存。将 150 尾受精后 4d（4dpf）野生型AB 品系斑马鱼随机分为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐阳性对照组（3.33g/mL）、蜂王浆酶解液冻干粉-1 组（LPR-1）和蜂王浆酶解液冻干粉-2 组（LPR-2）于 6 孔板中，每孔容量为 3mL，每组 30 尾。除正常组外，其它组斑马鱼采用水溶给予六水氯化铝（180mol/L）建立 AD 斑马鱼模型，实验组同时给予相应药物（浓度见表 2），28 处理 24h 后，测定样品对模型斑马鱼的 MTC。1.2.3运动功能障碍恢复功效评价随机选取 4dpf野生型 AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔（实验组）均处理 30 尾斑马鱼，参照“1.2.2”建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，28 处理 24h 后，每个实验组随机选择10 尾斑马鱼转移至 96 孔板中，200L/尾，1 尾/孔，利用行为分析仪采集数据，分析斑马鱼总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品运动功能障碍恢复功效。1.2.4反应能力改善功效评价随机选取 4dpf 野生型 AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔（实验组）均处理 30 尾斑马鱼，参照“1.2.2”建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，28 处理 24h 后，每个实验组随机选取10 尾斑马鱼，利用行为分析仪测定光暗刺激下斑马鱼的每分钟光暗速度差值，以该指标的统计学分析结果评价样品反应能力改善功效。1.2.5乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）抑制功效评价随机选取 4dpf 野生型 AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔（实验组）均处理 30 尾斑马鱼，参照“1.2.2”建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，28 处理 48h 后，将斑马鱼转移到 96 孔板，采用乙酰胆碱酯酶测定试剂盒，利用多功能酶标仪采集数据，分析斑马鱼分析斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶1617荧光值，以该指标的统计学分析结果评价样品对乙酰胆碱酯酶的抑制功效。1.2.6脑凋亡抑制功效评价随机选取 4dpf 黑色素等位基因突变 Albino 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔（实验组）均处理 30 尾斑马鱼。参照“1.2.2”建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，28 处理 24h 后，用吖啶橙（AO）对凋亡细胞进行染色，染色结束后每个实验组随机选择 10 尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用 NIS-ElementsD3.20 高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼脑部凋亡细胞的荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品对脑凋亡的抑制功效18。1.2.7对相关基因的影响随机选取 4dpf 野生型AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔（实验组）均处理30 尾斑马鱼。参照“1.2.2”建立斑马鱼阿尔茨海默症模型，28 处理 24h 后，使用 RNA 快速提取试剂盒提取斑马鱼总 RNA，用紫外-可见光分光光度计测定 RNA 的浓度及 A260/A280比值，A260/A280比值均在 1.82.2 之间19，表明提取得到斑马鱼总 RNA质量较好，可用于后续 qPCR 实验。引物序列见表 1。取 2.00g 斑马鱼样品总 RNA，按照 cDNA 第一链合成试剂盒说明操作，合成 20.0LcDNA，通过qPCR 检测-actin、TNF-、caspase-320和 BDNF21基因的表达。qPCR 方法：采用 CFX96 实时荧光定量聚合酶链反应体系（95 下 2min；95 下 5s，60 下 30s，40 个循环）。反应体积为 10L（cDNA4.5L，正向引物 0.25L，反向引物 0.25L，5LSYBRGreen）。用-actin 作为基因表达的内参，计算 TNF-、caspase-3 和 BDNF 基因的 RNA 相对表达量。表1引物序列信息Table1Primersequenceinformation基因引物序列-actinForward5-TCGAGCAGGAGATGGGAACC-3Reverse5-CTCGTGGATACCGCAAGATTC-3TNF-Forward5-AGGAGAGTTGCCTTTACCGC-3Reverse5-AATGGATGGCAGCCTTGGAA-3Caspase-3Forward5-GGACATGCGGATACGGAGAC-3Reverse5-TGCAGATGCCCCATCCTTAC-3BDNFForward5-TGGGTAAATCGCGACTGGTT-3Reverse5-CTGTTGGAACATTTTCCCCTATG-31.3数据处理统计学处理结果采用平均值标准误差（MeanSE）表示。用 SPSS26.0 软件进行统计学分析，P0.05表明差异具有统计学意义。采用 Origin2019软件作图。2结果与分析2.1最小中毒浓度（MTC）测定MTC 是药物引起毒性反应的最小浓度，其是药物安全性的评价指标之一22。由表 2 可知，LPR-1在浓度为 1000g/mL 时死亡率为 0%，且与模型对第44卷第21期刘俊财，等：蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响397照组状态相似。浓度为 2000g/mL 时死亡率为 33%。LPR-2 在浓度为 1000g/mL 时死亡率为 0%，且与模型对照组状态相似。浓度为 2000g/mL 时死亡率为 100%。综上，LPR-1，LPR-2 对防治阿尔茨海默症功效评价的 MTC 均为 1000g/mL。2.2运动功能障碍恢复功效评价运动能力下降是 AD 患者典型的临床表现之一，通过行为分析仪分析可检测样品改善斑马鱼运动能力的效果。由图 1 和图 2 可知，模型组斑马鱼总运动距离较正常组显著性下降（极显著，P0.001），表明造模成功，LPR-1 组，LPR-2 组和模型对照组比较，斑马鱼总运动距离延长，分别延长 1.8 倍（极显著，P0.001）和 0.7 倍（高度显著，P0.01），阳性对照盐酸多奈哌齐组延长 1.4 倍。实验结果表明 LPR-1，LPR-2 均具有对运动功能障碍恢复的功效。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐 3.33 g/mLLPR-1 1000 g/mLLPR-2 1000 g/mL图1样品处理后斑马鱼运动轨迹典型图Fig.1Typicalmotionpathofzebrafishaftersampletreatment注：黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离。2.3反应能力改善功效评价反应能力下降是 AD 患者典型的临床表现之一，通过明暗交替行为学实验可检测样品改善AD 斑马鱼对应激刺激的恢复能力。从图 3 可以看出，模型组斑马鱼每分钟平均速度均低于其他组，结合图 4 可知，模型组较正常组每分钟光暗速度差值极显著下降（P0.001），表明造模成功，LPR-1 组，LPR-2组和模型对照组比较，斑马鱼每分钟光暗速度差值均极显著延长（P0.001），分别延长 1.8 倍、2.1 倍，阳性对照盐酸多奈哌齐组延长 1.4 倍。实验结果表明LPR-1，LPR-2 均具有对反应能力改善的功效。6正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐 3.33 g/mLLPR-1 1000 g/mLLPR-2 1000 g/mL42每分钟平均速度(mm/s)0510时间(min)1520图3样品处理后斑马鱼每分钟平均运动速度Fig.3Averagemovementspeedofzebrafishperminuteaftersampletreatment注：横坐标黑白表示明暗交替，黑色为暗处理，白色为光处理。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-20.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0每分钟光暗速度差值(mm/s)#图4样品处理后斑马鱼每分钟光暗速度差值Fig.4Differenceoflightanddarkvelocityofzebrafishperminuteaftersampletreatment表2样品防治阿尔茨海默症功效浓度摸索实验结果（n=30）Table2ConcentrationofsampleforpreventionandtreatmentofAD(n=30)组别浓度（g/mL）死亡数（尾）死亡率（%）表型正常对照组00未见明显异常模型对照组00未见明显异常LPR-112500与模型对照组状态相似25000与模型对照组状态相似50000与模型对照组状态相似100000与模型对照组状态相似20001033LPR-212500与模型对照组状态相似25000与模型对照组状态相似50000与模型对照组状态相似100000与模型对照组状态相似200030100正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-20100020003000400050006000总运动距离(mm)#图2样品处理后斑马鱼总运动距离Fig.2Totalmovingdistanceofzebrafishaftersampletreatment注：与模型对照组比较，#表示差异显著（P0.05）；#表示差异高度显著（P0.01）；#表示差异极显著（P0.001）；图 4图 5，图 7图 10 同。398食品工业科技2023 年11月2.4乙酰胆碱酯酶抑制功效评价尽管阿尔茨海默病的病因尚不清楚，但使用乙酰胆碱酯酶抑制剂来减少神经递质乙酰胆碱的分解已经成为轻到中度阿尔茨海默病患者的主要对症治疗方式。乙酰胆碱酯酶抑制剂已被发现在广泛的动物模型中可以改善认知障碍，并已被中国用于阿尔茨海默病的治疗17。由图 5 可知，LPR-1 组，LPR-2 组和模型对照组比较，斑马鱼 AchE 荧光值均极显著降低（P0.001），分别降低 49%和 53%，阳性对照盐酸多奈哌齐组降低 49%。实验结果表明 LPR-1，LPR-2 均具有乙酰胆碱酯酶抑制功效。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-205000100001500020000乙酰胆碱酯酶(AchE)荧光值#图5样品处理后斑马鱼乙酰胆碱酯酶荧光值Fig.5FluorescencevalueofAchEofzebrafishaftersampletreatment2.5脑凋亡抑制功效评价斑马鱼脑区细胞凋亡情况检测脑区细胞凋亡是AD 典型的病理学特征之一，通过 AO 染色后可以对各组斑马鱼脑区细胞凋亡情况进行检测，验证斑马鱼 AD 样行为与脑区细胞凋亡的关联一致性18。从图 6 中可看出模型组的荧光颗粒较正常组显著增加，表明造模成功，图 7 经过定量分析显示，LPR-1、LPR-2 和模型对照组比较，斑马鱼脑部凋亡细胞荧光强度降低（高度显著，P0.01），分别降低 15%、21%，阳性对照盐酸多奈哌齐组降低 22%。实验结果表明LPR-1，LPR-2 均具有抑制斑马鱼脑凋亡功效。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐 3.33 g/mLLPR-1 1000 g/mLLPR-2 1000 g/mL图6样品处理后斑马鱼脑部凋亡细胞典型图Fig.6Typicalpictureofbrainapoptoticcellsofzebrafishaftersampletreatment注：黄色虚线框为分析区域，绿色荧光颗粒为脑部凋亡细胞。2.6对相关基因的影响炎性细胞因子 TNF-与阿尔茨海默病转基因小鼠记忆能力相关23。由图 8 可知，模型组较正常组TNF-基因相对表达量升高（高度显著，P0.01），表明造模成功，LPR-1、LPR-2 和模型对照组比较，斑马鱼 TNF-基因相对表达量显著降低（P0.01），分别降低 67%、53%，阳性对照盐酸多奈哌齐组降低 86%。实验结果表明 LPR-1，LPR-2 均具有下调 TNF-基因相对表达量功效。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-20.00.20.40.6TNF-基因相对表达量0.81.01.2#图8TNF-基因相对表达量Fig.8RelativeexpressionofTNF-gene星形胶质细胞增生和 caspase-3 的激活通常被认为是海马区细胞凋亡的主要标志24。由图 9 可知，模型组较正常组 caspase-3 基因相对表达量显著升高（P0.05），表明造模成功，LPR-1，LPR-2 和模型对照组比较，斑马鱼 caspase-3 基因相对表达量分别降低了 48%（P0.05）和 56%（高度显著，P0.01），阳性对照盐酸多奈哌齐组降低 58%。实验结果表明LPR-1，LPR-2 均具有下调 caspase-3 基因相对表达量功效。神经营养因子，如脑源性神经营养因子，对神经元的生存和生长是必不可少的。脑源性神经营养因子及其受体启动的信号转导通路是突触可塑性的关键调节因子，在学习记忆形成中起着重要作用。阿尔正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-2050000100000150000200000250000脑部凋亡细胞荧光强度(像素)#图7样品处理后斑马鱼脑部凋亡细胞荧光强度Fig.7Fluorescenceintensityofzebrafishbrainapoptoticcellsaftersampletreatment第44卷第21期刘俊财，等：蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响399茨海默病已经发现 BDNF 水平和信号通路的变化，BDNF 水平这些与疾病的症状和病程有关21。由图 10 可知，模型组较正常组 BDNF 基因相对表达量下降（高度显著，P0.01）表明造模成功，LPR-1，LPR-2 和模型对照组比较，斑马鱼 BDNF 基因相-对表达量极显著升高（P0.001），均升高 1.8 倍，阳性对照盐酸多奈哌齐组升高 2.8 倍。实验结果表明LPR-1，LPR-2 均具有上调 BDNF 基因表达的功效。正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-20.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5BDNF基因相对表达量#图10BDNF 基因相对表达量Fig.10RelativeexpressionofBDNFgene3结论不同蛋白酶酶解对肽活性具有一定影响，生物活性肽是对人类健康有积极影响的特定蛋白质片段，通常包括 220 个氨基酸残基，分子量6000Da。这些肽在亲本蛋白的序列内是无活性的，通过水解从母体蛋白中释放出来，具有特定的功效和较少的副作用。生物活性肽的功能特性活性取决于其氨基酸序列及其反映的结构特性。不同蛋白酶水解程度不同，酶切位点不同，所得到最终的序列也不同。LPR-1和 LPR-2 在制备过程中进行了蛋白酶的筛选，考察了五种商业蛋白酶抗氧化活性，实验结果表明，酸性蛋白酶酶解效果最好，其次是碱性蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶效果较差。目前用于治疗 AD 的药物主要有乙酰胆碱酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、吡拉西坦及其他一些具有缓解 AD 症状的药物。乙酰胆碱酶抑制剂如他克林、加兰他敏、利斯的明等都存在消化道不良反应，应谨慎应用；谷氨酸受体拮抗剂如美金刚可以降低神经元的损伤情况但存在一些头晕、头痛的不良反应25。蜂王浆属于天然食物，蜂王浆肽具有更高的稳定性、安全性，利用高效、便捷、安全的酶解法和微生物发酵法，经过工艺的合理控制，可以提供特定的生产条件实现产品的一致性，可广泛应用于肽的大量生产。Sang 等26表明以斑马鱼模型具有进行探究AD 机制的可行性。AD 发病机制复杂，现代医学认为，细胞凋亡27，TNF 炎症因子与 AD 发病密切相关。任擎宇等18通过 TUNEL 染色法探究金盏菊对AD 斑马鱼的影响，结果表明造模组凋亡细胞数明显增多，与 Hadipour 等28研究趋势一致，而在经过金盏菊处理后，AD 斑马鱼脑区凋亡细胞数目显著减少；细胞凋亡又与 Caspase 家族29密切相关，所以其也与 AD 患者认知、行为功能障碍异常有关30，王玥等31等表明阿魏酸可通过降低 Caspase-3 表达水平改善 AD 小鼠脑内细胞凋亡；Drews 等23研究表明，TNF 炎症因子降低后 AD 小鼠星形胶质细胞迁移特性显著改善脂质和蛋白质等的过氧化与 AD 相关，其影响区域主要位于海马区和内嗅皮层。通过蛋白质组分分析 AD 患者大脑，发现了大量氧化功能丧失的蛋白质，而这些蛋白质在能量代谢，细胞代谢等通路上至关重要。AD 患者的临床和动物实验表明，在 AD 患者早期已经出现了氧化损伤，氧化应激标志物含量明显升高。在轻度认知障碍患者和 AD 患者中都观察到超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶等含量明显降低，脂质过氧化产物 MDA 含量显著上升。A 和金属离子动态平衡紊乱等因素诱导产生的氧化应激是阿尔茨海默病形成的关键因素。本实验研究结果显示，LPR-1，LPR-2 蜂王浆肽均具有防治阿尔茨海默症功效，其机制可能与下调 caspase-3 基因水平，降低 TNF-基因相对表达量，上调 BDNF基因表达，抑制脑部细胞凋亡，抑制氧化应激，减轻炎症反应有关。这些发现将为蜂王浆肽防治阿尔茨海默症提供依据。参考文献1DUBOISB,FELDMANHH,JACOVAC,etal.AdvancingresearchdiagnosticcriteriaforAlzheimersdisease:TheIWG-2cri-teriaJ.TheLancetNeurology，2014，13（6）：614629.2OSSENKOPPELER,PIJNENBURGYaL,PERRYDC,etal.The behavioural/dysexecutive variant of Alzheimers disease:Clinical,neuroimaging and pathological featuresJ.Brain，2015，138（9）：27322749.3JESSENF,AMARIGLIORE,VANBOXTELM,etal.AconceptualframeworkforresearchonsubjectivecognitivedeclineinpreclinicalAlzheimersdiseaseJ.AlzheimersDement，2014，10（6）：84452.4 SCHELTENS P,BLENNOW K,BRETELER M,et al.AlzheimersdiseaseJ.TheLancet，2016，388（10043）：505517.正常对照组模型对照组盐酸多奈哌齐LPR-1LPR-20.00.20.40.60.81.01.2caspase-3基因相对表达量#图9caspase-3 基因相对表达量Fig.9Relativeexpressionofcaspase-3gene400食品工业科技2023 年11月5ZHANGXX,TIANY,WANGZT,etal.TheepidemiologyofAlzheimersdiseasemodifiableriskfactorsandpreventionJ.JPrevAlzheimersDis，2021，8（3）：313321.6SELKOEDJ,HARDYJ.TheamyloidhypothesisofAlzh-eimersdiseaseat25yearsJ.EMBOMolMed，2016，8（6）：595608.7ALIAM,KUNUGIH.Royaljellyasanintelligentanti-agingagent-afocusoncognitiveagingandAlzheimersdisease:AreviewJ.Antioxidants（Basel），2020，9（10）：937,246.8KAWAHATAI,XUH,TAKAHASHIM,etal.Royaljellycoordinatelyenhanceshippocampalneuronalexpressionofsomato-statin and neprilysin genes conferring neuronal protection againsttoxicsolubleamyloid-oligomersimplicatedinAlzheimersdiseasepathogenesisJ.JournalofFunctionalFoods，2018，51：2838.9PANY,XUJ,CHENC,etal.Royaljellyreducescholesterollevels,amelioratesabetapathologyandenhancesneuronalmetabol-icactivitiesinarabbitmodelofAlzheimersdiseaseJ.FrontAg-ingNeurosci，2018，10：50.10YOUM,PANY,LIUY,etal.Royaljellyalleviatescogni-tive deficits and beta-amyloid accumulation in APP/PS1 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