分子蒸馏技术分步法制备酶促酯交换反应的高含量ω-3 PUFA鱼油甘油酯.pdf
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1、食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.20 79分子蒸馏技术分步法制备酶促酯交换反应的 高含量-3 PUFA鱼油甘油酯沈琳洁,林荣发,张连岳,冯传志,傅 红*(福州大学生物科学与工程学院,福建 福州 350108)摘 要:研究采用分子蒸馏技术分步法处理多级酶促鱼油酯交换反应产物,获得高含量-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)甘油酯。首先通过一级分子蒸馏分离鱼油酯交换产物中的甘油酯和副产物,当蒸馏压强5 Pa、蒸馏温度140、刮板转速240 r/min和进料速率0.2 mL/min时,得率为47.13%的一级重相-3 PUFA含量达到5
2、3.76%,高温气相色谱及核磁共振氢谱都证明一级重相不含乙酯型鱼油;其次,当蒸馏压强5 Pa、蒸馏温度110、刮板转速240 r/min和冷凝温度20 时,分子蒸馏可以将一级轻相中的-3 PUFA含量从60.73%富集到78.01%,此一级轻相富集相参与二级酶促酯交换反应和分子蒸馏分离后,获得得率为46.23%并含有51.38%-3 PUFA的二级重相。若一级轻相直接参与二级酯交换反应和分离,其二级重相-3 PUFA含量仅为42.37%。采用多级酶促酯交换反应和多步分子蒸馏方法可以制备不同-3 PUFA含量等级的甘油酯型鱼油产品,并实现原料和副产物的最大化利用。关键词:酶促酯交换;分子蒸馏;鱼
3、油;-3多不饱和脂肪酸;甘油酯Multistep Molecular Distillation for the Preparation of Glyceride-Type Fish Oil High in Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acid by Enzymatic TransesterificationSHEN Linjie,LIN Rongfa,ZHANG Lianyue,FENG Chuanzhi,FU Hong*(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou
4、 350108,China)Abstract:The separation of glyceride fish oil high in omega-3 polyunsaturated fatty acid(-3 PUFA)produced by multistage enzymatic transesterification was studied by multistep molecular distillation.Firstly,glycerides and by-products in the transesterification products were separated by
5、 primary molecular distillation.When the distillation pressure was 5 Pa,the distillation temperature was 140,the scraper speed was 240 r/min,and the feeding rate was 0.2 mL/min,the yield of the first-stage heavy phase was 47.13%and the content of-3 PUFA in it was 53.76%.Meanwhile,high-temperature ga
6、s chromatography(HTGC)and nuclear magnetic resonance hydrogen(1H-NMR)spectroscopy consistently showed that the heavy phase did not contain fish oil ethyl ester.Secondly,the-3 PUFA content of the light phase increased from 60.73%to 78.01%by molecular distillation at a distillation pressure of 5 Pa,a
7、distillation temperature of 110,a scraper speed of 240 r/min,and a condensation temperature of 20.After conducting secondary enzymatic transesterification reaction and molecular distillation separation on the enriched first-stage light phase,the yield of the second-stage heavy phase was 78.01%and it
8、s-3 PUFA content was 51.38%.When the enrichment step was omitted,the content of-3 PUFA in the second-stage heavy phase was only 42.37%.Multistep molecular distillation combined with multistage enzymatic transesterification can be used to prepare glyceride-type fish oil products with different-3 PUFA
9、 contents,with maximal utilization of raw materials and by-products.Keywords:enzymatic transesterification;molecular distillation;fish oil;-3 polyunsaturated fatty acid;glycerideDOI:10.7506/spkx1002-6630-20230207-065中图分类号:TS228 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)20-0079-08收稿日期:2023-02-07基金项目:福建省科技厅高校产学合作项目
10、(2021N5006);福州市科技重大项目(2021-ZD-216);福建省特种水产配合饲料重点实验室项目(TMKJZ2006)第一作者简介:沈琳洁(1998)(ORCID:0000-0003-4655-3519),女,硕士,研究方向为食品工程。E-mail:*通信作者简介:傅红(1970)(ORCID:0000-0001-7805-9473),女,教授,博士,研究方向为油脂化学。E-mail:80 2023,Vol.44,No.20 食品科学 食品化学引文格式:沈琳洁,林荣发,张连岳,等.分子蒸馏技术分步法制备酶促酯交换反应的高含量-3 PUFA鱼油甘油酯J.食品科学,2023,44(20)
11、:79-86.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230207-065.http:/SHEN Linjie,LIN Rongfa,ZHANG Lianyue,et al.Multistep molecular distillation for the preparation of glyceride-type fish oil high in omega-3 polyunsaturated fatty acid by enzymatic transesterificationJ.Food Science,2023,44(20):79-86.(in Chinese with
12、English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230207-065.http:/海洋浮游植物和藻类含有的-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)经食物链参与海洋鱼类脂质代谢1,其中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)在预防和治疗心血管疾病、癌症、糖尿病、炎症等方面发挥重要作用2-6。天然深海鱼油中EPA和DHA以构成甘油三酯(triacylglycerol,TG)的脂肪酸形式存在,其总含量一般不超过30%;利用
13、化学醇解及浓缩技术制备的乙酯型鱼油可以将-3 PUFA含量提高到50%以上7。但是近年研究发现,乙酯中的-3 PUFA不仅比TG需要额外的羧基脂肪酶水解,而且对胰脂肪酶水解抵抗能力比TG高50 倍,这显著降低了乙酯中-3 PUFA的消化吸收效率8-10;另外乙酯在体内分解产生的乙醇容易引发乙醇不耐症人群和婴幼儿的不良反应11。因此,制备食用安全性好和生物利用率高的高-3 PUFA含量甘油酯型鱼油产品,成为特医食品等领域的新经济增长点,目前挪威、丹麦、韩国等在此领域已具备较成熟的商业化技术,我国正处于研发和试生产阶段12。利用脂肪酶油脂改性技术,以天然鱼油和乙酯型鱼油为底物制备高-3 PUFA含
14、量的鱼油甘油酯产品是目前鱼油高附加值产业发展方向13-14。现有文献主要集中于脂肪酶类型选择和反应条件参数优化,对酯交换产物的分离及其副产物再利用的研究较少。乙酯型鱼油原料价格贵,利用传统的减压分离技术难以完全分离成分复杂的酯交换产物鱼油甘油酯,成为限制工业化生产的重要因素。分子蒸馏技术加热温度低、受热时间短,可以根据脂肪酸碳链长度和饱和程度对油脂热敏性成分进行高效的多组分分离。在酯交换混合产物分离方面,He Jianlin等15报道了酶促乙醇反应结合分子蒸馏技术提高藻油DHA含量的方法,蒸馏温度150 和真 空度1103 MPa分离得到富含DHA甘油酯的重组分和含有棕榈酸、DHA乙酯的轻组分
15、;Wang Xiumei等16用酶催化乙酯与甘油反应生成含有76.46%TG的产物,分子蒸馏温度175、真空度3 Pa时分离产物中的甘油二酯和乙酯,最终将TG含量提高至96.2%;tefan等17分离山茶油中的游离脂肪酸时,分子蒸馏的脱酸效率可达92%。另外,在PUFA富集方面,傅红等18通过二级分子蒸馏,获得了63%-3 PUFA含量的乙酯型鱼油;余瑶盼等19在真空压力1 Pa、一级蒸馏温度120 和二级蒸馏温度 160 时,将石榴籽油共轭亚麻酸乙酯含量从80.68%提升至95.23%。本研究在脂肪酶促酯交换技术制备高-3 PUFA含量的鱼油甘油酯产品研究基础上13,20-23,采用分子蒸馏
16、法分步应用于鱼油酯交换反应产物的分离。通过一级分子蒸馏技术分离鱼油酯交换产物中的一级重相产物甘油酯(包括TG、甘油二酯和甘油单酯)和一级轻相副产物,并采用高温气相色谱及核磁共振氢谱等技术验证产物的分离效果;将一级轻相副产物直接参与下一级的酶促酯交换反应中,或再通过分子蒸馏技术富集轻相乙酯副产物中的-3 PUFA,参与下一级的酶促酯交换反应,以此制备不同-3 PUFA含量等级的甘油酯型鱼油产品,实现原料和副产物的最大化利用,降低原料成本。分子蒸馏技术在酶促酯交换产物分离工艺中的高效使用,可以为实现绿色、能源节约型高含量-3 PUFA的鱼油甘油酯产业化生产奠定基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂
17、原料TG型鱼油(-3 PUFA含量30%)、原料乙酯型鱼油(-3 PUFA含量75%)福建天马科技集团有限公司;固定化脂肪酶LipozymeTLIM丹麦诺维信 公司;正己烷等其他试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备FMD-150分子蒸馏仪 杜马司科学仪器(江苏)有限公司;AVANCE NEO 600核磁共振波谱仪 德国Bruker公司;GC7890A气相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;CH1020B超级恒温水浴槽 沙鹰科学仪器(上海)有限公司;HJ-4A磁力搅拌器 北京浩开科技有限公司;DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。1.3 方法1.3.1 酶促酯交换产物
18、制备以质量比1 1将TG型鱼油和乙酯型鱼油作为反应底物置于夹套烧杯中,加入3%(以原料总质量计)的固定化脂肪酶LipozymeTLIM,密封烧杯口后于52 恒温磁力搅拌器避光反应24 h20。酯交换反应结束后,80 保持20 min使酶灭活,8 000 r/min离心10 min去除脂肪酶固体,得到一级酯交换反应产物鱼油混合酯。食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.20 811.3.2 分子蒸馏分步制备工艺在体系压强5 Pa、蒸馏温度140、刮板转速 240 r/min和进料速率0.2 mL/min的一级分子蒸馏优化条件下,分离一级酯交换产物获得分离产物一级重相和一级轻相。其中一级
19、轻相既可直接参与二级酯交换反应和分子蒸馏分离(反应条件和一级相同),也可将一级轻相再经分子蒸馏富集其中的-3 PUFA后,再参与二级酯交换反应和分子蒸馏分离。上述工艺得到不同等级的鱼油甘油酯产品,工艺流程图如图1所示。?TG?TG?-3 PUFA?图 1 不同-3脂肪酸含量等级的甘油酯型鱼油产品的分步制备Fig.1 Flow chart for the preparation of triglyceride-type fish oil products with different-3 fatty acid contents1.3.2.1 酯交换混合产物中甘油酯的分离称取一定量酯交换产物鱼油加
20、入分子蒸馏加料罐,探究分子蒸馏体系压强、蒸馏温度、刮板转速和进料速率对重相中的甘油酯型鱼油-3 PUFA(EPADHA)含量的影响。将薄层制备色谱法得到的酯交换反应产物中甘油酯混合谱带(包括TG、甘油二酯和甘油单酯三条谱带)-3 PUFA含量作为标准值,按下式计算分子蒸馏重相中的-3 PUFA含量和前者的相对偏差,相对偏差越小,说明分离效果越好,其中-3 PUFA含量由气相色谱法测定。?-3 PUFA?/%?|X1?X2|?100X2(1)式中:X1为分子蒸馏重组分中-3 PUFA含量;X2为薄层制备色谱甘油酯中-3 PUFA含量。1.3.2.2 分子蒸馏富集一级轻相的-3 PUFA称取一定量
21、一级轻相加入分子蒸馏加料罐,在体系压强5 Pa时探究刮板转速、冷凝温度和蒸馏温度对一级轻相中的-3 PUFA富集效果的影响。收集-3 PUFA富集相,经气相色谱检测其EPADHA含量,并按下式计算乙酯型鱼油富集相得率。?/%?m?100m?(2)式中:m富为富集相乙酯型鱼油的质量/g;m进为进料乙酯型鱼油的质量/g。1.3.3 薄层色谱法分析产物及制备甘油酯称取一定量样品溶解于50L正己烷,用定量点样毛细管吸取1L在距薄层板底边2 cm处点上直径 4 mm的圆点,放入展开缸中(展开剂为正己烷乙醚 甲酸=80 20 2,V/V)。利用上行法展开,待展开剂上升至距薄层板顶端2 cm处时取出晾干,喷
22、洒茴香醛显色剂,在110 加热条件下根据Rf值判断各脂质组分24。将30 mg未经分子蒸馏分离的酶促酯交换反应混合产物溶解于50L正己烷,均匀点样于20 cm20 cm薄层板上并连成1 条直线,用展开剂(正己烷 乙醚 乙酸=80201,V/V)进行层析,展开结束晾干后喷洒 2,7-二氯荧光素显色剂,在紫外灯下观察并刮下甘油酯混合谱带(包括TG、甘油二酯和甘油单酯3 条谱带)对应区域25-26。按上述方法收集制备的35 份混合谱带样品,气相色谱分析脂肪酸含量。1.3.4 分离产物的甘油酯成分和脂肪酸组成分析1.3.4.1 高温气相色谱法测定分子蒸馏分离产物组成取样品溶解于正己烷溶剂中,通过高温气
23、相色谱法分析重组分组成。色谱条件:Agilent 7890A气相色谱仪;Agilent VF-5ht高温柱子;检测器为氢火焰离子化检测器;进样口温度325,检测器温度340,色谱柱升温程序:以5/min从50 升到400。进样量2L,分流比为100 127。1.3.4.2 气相色谱法测定脂肪酸组成样品采用甲酯化处理,经气相色谱法测定脂肪酸组成。色谱条件:Agilent 7890A气相色谱仪;Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性柱;氢火焰离子化检测器;进样口温度250,检测器温度280;色谱柱升温程序:40 保持2 min,以55/min升至171,保持25 min,再以10/mi
24、n升至215,保持25 min,直至分析完成;载气为纯氮气,流速30 cm/s,横流模式,氢气流速 40 mL/min;空气流速400 mL/min,尾吹气为氮气,流速为25 mL/min,进样量1L,分流比为20 128。1.3.5 核磁共振氢谱法分析甘油酯分离效果分别称取50 mg样品溶于500L氘代氯仿后装入5 mm核磁管,置于600 MHz运行的核磁共振波谱仪测试,获得核磁共振氢谱。参数条件:以四甲基硅烷为内标物,扫描次数32 次,脉冲宽度90,采集时间2.752 5 s,谱宽12106,脉冲间隔1 s,脉冲序列zg3029。1.4 数据处理与分析采用Origin 2021软件绘图,并
25、使用MestReNova软件分析核磁共振氢谱图。数据为3 次实验测定的平均值,以s表示。82 2023,Vol.44,No.20 食品科学 食品化学2 结果与分析2.1 薄层色谱法分析产物成分在前期工艺参数优化酶促原料TG型鱼油和原料乙酯型鱼油的酯交换反应基础上13,20-21,采用分子蒸馏技术分离酯交换产物的甘油酯,分离产物为分子蒸馏重相和分子蒸馏轻相两部分。图2是反应底物、酯交换反应后的混合产物及其一级分子蒸馏效果较完全的分离产物(一级重相、一级轻相)薄层色谱图,其中重相在胆固醇酯、TG、甘油二酯和甘油单酯所对应的谱带上有清晰的斑点,轻相则含有乙酯型鱼油和游离脂肪酸的斑点。因此由薄层色谱图
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