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番茄早疫病菌拮抗菌筛选潘朝勃,黄 灏,张 珍,陈嘉洛,朱启明(广东茂名农林科技职业学院 生物技术系,广东 茂名 5 2 5 0 0 0)摘要:为进一步筛选番茄早疫病菌生防菌,通过叶片表面接触法,从广东茂名地区健康番茄植株叶片表面分离筛选拮抗菌,获得具有对峙生长拮抗作用的菌株5 2株,对拮抗作用最强的前6株菌进行液体培养,提取离心上清滤液进行抑菌活性测试。结果表明,6株拮抗菌均能产生胞外抑菌物,有5株拮抗菌的胞外物抑菌率达7 0%以上,最高抑菌率为7 8.1 2%。关键词:番茄早疫病;叶表;拮抗;筛选番茄是世界上重要的经济作物,番茄早疫病是番茄重要的世界性病害之一,病原菌为茄链格孢菌(A l t e r n a-r i a s o l a n i),危害番茄的叶、茎和果实,一般年份发病率在1 0%左右,造成产量损失1 0%3 0%;流行年份发病率可达1 0 0%,产量损失达3 0%4 0%,严重时损失可达5 0%以上1,2。目前番茄早疫病主要以化学药剂防治为主,长期使用化学药剂容易诱发病菌抗药性和引起环境污染以及食物安全问题3-5。生物防治具有克服化学药剂缺点的优势,对环境危害污染小,适合可持续发展,不易诱发病菌抗药性等特点,已逐渐成为重要的防治手段6-8,国内关于番茄早疫病的生物防治研究显示了较好的前景,如陈羽等9分离筛选的拮抗细菌B 7 3 1能在番茄植株和土壤中定植,叶面处理获得8 1.8 3%的试验防效,丘麒等1 0获得的植物提取物对番茄早疫病菌的抑菌率达到7 8.0 8%。近年来,随着广东茂名地区番茄种植面积不断扩大,该地区番茄早疫病出现了日益严重的趋势,为促进茂名地区番茄产业的可持续发展,为该地区番茄早疫病提供新的防治思路,同时为拓展生防菌筛选来源,扩充番茄早疫病菌的生防菌资源,本试验在茂名当地采集了健康番茄植株的叶片,从叶片表面分离筛选对番茄早疫病菌具有拮抗作用的生防菌,以期为进一步的生防应用研究提供理论依据和材料选择。1 材料与方法1.1 材料a.番茄早疫病菌(A l t e r n a r i a s o l a n i)菌株,为广东茂名农林科技职业学院生物技术系植病实验室分离保存菌株。b.P D A培养基:马铃薯2 0 0 g(煮汁),葡萄糖1 0 g,琼脂粉1 6 g,加蒸馏水至1 0 0 0 m L。P D B培养基:马铃薯2 0 0 g(煮汁),葡萄糖1 0 g,加蒸馏水至1 0 0 0 m L。c.菌株分离材料来源:广东茂名农林科技职业学院种植实习基地和学校周边番茄种植地的健康番茄植株叶片。d.主要仪器:超净工作台(SW-C J-2 F,苏州净化)、光照培养箱(S P X-1 5 0 C,江苏科析仪器有限公司)、恒温振荡器(S H Z-8 2,江苏省金坛市环宇科学仪器厂)、高压蒸汽灭菌锅(Y X Q-1 0 0 S I I,上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、低温高速冷冻离心机(H 1 8 5 0 R,湖南湘仪)。1.2 方法1.2.1 待测菌株分离纯化将采回的健康番茄叶片正反面分别与P D A平板接触5 s,将该平板置于培养箱中2 6自然光照培养。培养期间定期观察,挑取外观形态颜色明显差异的菌落进行纯化培养,作为拮抗作用待测菌株保存备用。1.2.2 平板对峙生长法拮抗测试在P D A平板中央接上5 mm番茄早疫病菌菌饼,于均等四方向接入待测菌株,病菌中心与待测菌株接种点相距3 5 mm,以不接入待测菌的平板作对照,各重复3板,置光照培养箱中2 6 自然光培养,待对照平板上病菌菌落生长至平均半径为3 5 mm,测量测试平板上病菌与对应待测菌株连线方向上的病菌菌落生长宽度。收稿日期:2 0 2 3-0 2-1 7基金项目:广东茂名农林科技职业学院2 0 2 1年校级教研科研资金资助项目作者简介:潘朝勃(1 9 8 1-),男,硕士,农艺师,主要从事植物病害及其防治研究。5 现代化农业 2 0 2 3年第1 2期(总第5 3 3期)1.2.3 拮抗菌胞外物抑菌测试将经平板对峙生长法拮抗筛选出来的拮抗菌株分别各挑取菌苔1接种环接种于P D B培养基中,在恒温振荡器2 81 8 0 r/m i n培养4 d,抽取培养液于低温高速冷冻离心机41 5 0 0 0 r/m i n离心2 5 m i n,抽取上清液经0.2 2m滤膜过滤得各拮抗菌的培养液上清滤液,于4保存备用。同时各吸取少量上清滤液接种于P D A培养基平板,2 6培养3 d,未发现菌落生长,确认上清滤液中无菌体。将各上清滤液分别和P D A培养基按1 9的比例混合制成含上清滤液浓度为1 0%的平板(6 0 mm培养皿),将番茄早疫病菌5 mm菌饼接种于平板中央,同时以无菌水代替上清滤液作对照处理,各处理重复3板,在光照培养箱中2 6自然光培养3 d,用十字交叉法测量各处理平板病菌菌落生长直径,计算各拮抗菌株培养液上清滤液对病菌菌落生长的抑制率。1.3 计算公式病菌菌落生长抑制率(%)=(对照处理菌落生长直径-上清滤液处理菌落生长直径)/对照处理菌落生长直径1 0 0。2 结果与分析2.1 待测菌株的拮抗筛选对待测菌株进行平板对峙生长法拮抗测试,获得5 2株对番茄早疫病菌具有拮抗效果的菌株(见表1)。病菌受到拮抗菌的拮抗作用,菌落生长受到抑制,病菌菌落生长宽度越小表明受到对应拮抗菌的拮抗作用越大。从表1可见拮抗作用较强排在前3名的拮抗菌株分别是菌4 3、菌3 0和菌4 8,其拮抗的病菌菌落平均生长宽度均小于病菌中心与拮抗菌接种点之间距离的一半(1 7.5 mm);其次3个菌株为菌1 7、菌2 5和菌2 6,其拮抗的病菌菌落平均生长宽度约等于病菌中心与拮抗菌接种点之间距离的一半(1 7.5 mm)。因此,选取菌4 3、菌3 0、菌4 8、菌1 7、菌2 5和菌2 6进行胞外物抑菌测试。表1 5 2株拮抗菌对番茄早疫病菌对峙生长拮抗效果mm菌株病菌生长平均宽度菌株病菌生长平均宽度菌株病菌生长平均宽度菌株病菌生长平均宽度菌4 31 4.0 3菌11 9.1 2菌1 12 4.3 1菌42 9.0 0菌3 01 4.7 2菌51 9.2 2菌2 32 4.7 2菌3 12 9.0 1菌4 81 5.7 1菌1 41 9.2 1菌4 72 5.0 3菌72 9.1 1菌1 71 7.7 1菌81 9.3 1菌5 12 5.0 3菌32 9.2 1菌2 51 7.7 2菌4 12 0.0 2菌3 22 5.3 2菌3 92 9.3 2菌2 61 7.7 3菌1 22 0.3 3菌4 52 5.7 0菌2 72 9.7 1菌21 8.2 1菌2 42 0.3 0菌3 82 6.0 2菌4 42 9.7 3菌1 01 8.3 2菌3 52 0.3 1菌3 42 7.0 2菌1 93 0.0 2菌61 8.3 0菌1 32 0.7 0菌2 12 7.7 1菌2 83 0.2 0菌2 21 8.7 1菌1 62 1.7 2菌4 92 7.7 3菌5 23 0.3 1菌3 31 8.7 2菌2 02 1.7 1菌4 02 8.0 1菌1 53 1.0 1菌91 9.0 4菌4 22 1.7 3菌5 02 8.3 1菌4 63 1.0 2菌1 81 9.0 4菌2 92 2.3 0菌3 62 8.7 2菌3 73 1.3 12.2 拮抗菌株胞外物抑菌测试通过对拮抗作用较强的6个菌株的液体培养胞外物的抑菌活性测试,获得抑菌效果见表2。6株拮抗菌的培养液上清滤液对病菌菌落生长具有明显的抑制作用,表明该6株菌均能产生胞外抑菌物,是在对峙生长测试中表现拮抗作用的原因之一,其中最高抑菌率为7 8.1 2%(菌4 8),最低抑菌率为6 7.2 2%(菌3 0)。2.3 6株拮抗菌对峙生长拮抗效果与其胞外物抑菌效果比较将6株拮抗菌对峙生长拮抗作用和其胞外物抑菌作用的强弱从大到小排序(见表3),对峙生长拮抗作用由强到弱为菌4 3菌3 0菌4 8菌1 7菌2 5菌2 6,而胞外物抑菌作用由强到弱为菌4 8菌2 5菌1 7菌4 3菌2 6菌3 0。从排序看,对峙生长的拮抗作用强弱与其胞外物抑菌作用强弱没有一致性。6 现代化农业 2 0 2 3年第1 2期(总第5 3 3期)表2 6株拮抗菌胞外物对番茄早疫病菌生长的抑制效果菌株病菌生长平均直径 mm抑菌率%菌4 81 0.2 27 8.1 2菌2 51 0.3 27 7.9 1菌1 71 0.7 37 7.0 3菌4 31 1.5 17 5.3 6菌2 61 3.8 27 0.4 1菌3 01 5.3 16 7.2 2C K4 6.7 1表3 6株拮抗菌对峙生长拮抗作用和胞外物抑菌作用强弱比较菌株菌落生长宽度 mm菌株抑菌率%菌4 31 4.0 1菌4 87 8.1 2菌3 01 4.7 2菌2 57 7.9 1菌4 81 5.7 1菌1 77 7.0 3菌1 71 7.7 1菌4 37 5.3 6菌2 51 7.7 2菌2 67 0.4 1菌2 61 7.7 2菌3 06 7.2 23 结论与讨论自然界存在大量的拮抗微生物,是植物病菌生防菌的主要来源,筛选番茄早疫病菌生防菌对将来的安全防治和有效防治具有重要基础意义。目前番茄早疫病菌的拮抗菌主要从根际土壤微生物、植株内生菌及海洋环境等中分离筛选获得,并具有一定的防病效果1 1-1 3,而周防震等1 4从一些健康果实的表皮组织上分离到拮抗番茄早疫病菌的拮抗酵母菌,但从健康番茄叶片表面筛选获得番茄早疫病菌拮抗菌鲜有报道,本试验成功从健康番茄叶片表面分离筛选获得拮抗菌5 2株,进一步佐证了健康植株表面微生物也是植物病菌拮抗微生物的重要资源。拮抗菌分泌胞外抑菌物是重要的拮抗机制之一,本试验中6株拮抗菌1 0%浓度的培养液离心上清滤液具有明显的抑菌效果,表明其菌体向外分泌具有较强抑菌作用的物质,其胞外抑菌物是拮抗作用的主要原因之一,具有进一步研究和开发利用的意义。从表3排序看,两种不同的测试方法对番茄早疫病菌生长的影响大小没有一致性,说明同一株菌在两种培养条件下虽均表现出抑菌作用,但抑菌作用大小不相同,表明其胞外抑菌物的产生受到培养条件的影响。不同生境的微生物资源不尽相同,本试验首次在广东茂名地区分离筛选获得番茄早疫病菌的拮抗菌株,对茂名地区生防菌资源的数据积累和作物病害生物防治起到一定的促进意义,同时也拓展了生防菌筛选来源,扩充番茄早疫病菌的生防菌资源。本次分离获得的拮抗菌株其抑菌物产生及抑菌机理与防病效果有待进一步研究。4 参考文献1 吴仁锋,汪志红.番茄早疫病研究概述J.中国植保导刊,2 0 0 9,2 9(3):1 6-1 8.2 王彦杰,刘守伟,李景富.番茄抗早疫病育种研究进展J.东北农业大学学报,2 0 0 4,3 5(5):6 1 6-6 2 1.3 何建清,张格杰,岳海梅,等.番茄早疫病菌拮抗放线菌1 0-4的鉴定J.植物保护学报,2 0 1 0,3 7(4):3 0 7-3 1 2.4 马原松,裴冬丽,张灵君.不同番茄品种对早疫病的抗病性研究J.江苏农业科学,2 0 1 1(1):1 3 7-1 3 9.5 周明国.植物病原物抗药性M.北京:中国农业出版社,1 9 9 8:5 0-6 1.6 胡青平.番茄早疫病菌(A l t e r n a r i a s o l a n i)广谱拮抗微生物的选育及拮抗机理研究D.西安:西北大学,2 0 0 8.7 邢袆博.番茄早疫病生防细菌7-1 9菌株的研究及其抗菌蛋白质的分离纯化D.保定:河北农业大学,2 0 1 0.8 牛明杨.番茄早疫病拮抗细菌的筛选及其拮抗作用的研究D.西安:西北大学,2 0 1 2.9 陈羽,张顺琦,陈夕军,等.番茄早疫病生防细菌B 7 3 1的分离、鉴定及抑菌防病作用J.中国生物防治学报,2 0 1 5,3 1(3):3 6 1-3 6 8.1 0 丘麒,罗建军,郝卫宁,等.2 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