剁椒萝卜后熟期微生物多样性与风味品质分析.pdf
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1、安莲霞,苏伟,母应春,等.剁椒萝卜后熟期微生物多样性与风味品质分析 J.食品工业科技,2023,44(19):128139.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120232AN Lianxia,SU Wei,MU Yingchun,et al.Analysis of Microbial Diversity and Flavor Quality of Chopped Pepper Radish in Post-ripeningJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):128139.(in Chines
2、e with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120232 生物工程 剁椒萝卜后熟期微生物多样性与剁椒萝卜后熟期微生物多样性与风味品质分析风味品质分析安莲霞1,2,苏伟1,2,*,母应春1,尹学东3(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州大学贵州省农畜产品储藏加工技术重点实验室,贵州贵阳 550025;3.贵三红食品有限公司,贵州遵义 563099)摘要:了解剁椒萝卜后熟期微生物群落和挥发性成分的变化对于揭示发酵辣椒独特风味的形成尤为重要。本研究采用高通量测序(High Throughput Seq
3、uencing,HTS)和顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(Headspace SolidPhase Microextraction Gas Chromatography-Mass Spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对剁椒萝卜后熟期微生物群落和挥发性化合物进行了分析,并建立了它们之间的相关性。结果表明:共筛选出 21 个优势细菌属和 11 个优势真菌属(平均相对丰度大于 1%)。感官分析表明剁椒萝卜经后熟处理后风味和滋味显著提高(P0.7 且 P0.05)与 29 种重要差异挥发性风味物质显著相关,其中片球菌属、乳球菌属和青霉属分别与 11、6 和 5 种风味物质呈显著相
4、关。研究结果反映了剁椒萝卜后熟期代谢物变化规律,为剁椒萝卜品质提升提供了数据支撑。关键词:剁椒萝卜,高通量测序,微生物,挥发性风味物质,相关性分析本文网刊:中图分类号:TS255.54 文献标识码:A 文章编号:10020306(2023)19012812DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120232AnalysisofMicrobialDiversityandFlavorQualityofChoppedPepperRadishinPost-ripeningANLianxia1,2,SUWei1,2,*,MUYingchun1,YINXuedong3(1.Sch
5、ool of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Storage and Processing Technology Agricultural and Livestock Products,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guisanhong Food Co.,Ltd.,Zunyi 563099,China)Abstract:Comprehending the changes in the microbi
6、al community and volatile substances throughout the post-ripeningstage of chopped pepper radish is particularly important for revealing the formation of the distinctive flavor of fermentedpeppers.The microbial communities and volatile compounds of chopped pepper radish in the post-ripening stage wer
7、eexamined in this work using high-throughput sequencing (HTS)and headspace solid phase microextraction gaschromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC-MS),as well as their underlying correlations.Results indicated that 11dominant fungal genera and 21 dominant bacterial genera(average relative abundan
8、ce more than 1%)were filtered out.Sensory analysis showed that the flavor and taste of chopped pepper radish were significantly improved after post-ripening(P0.7 and P99.5%,色谱纯)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;OMEGA-soil DNA KitDNA 抽提试剂盒美国 Omega Bio-Tek;AxyPrepDNA Gel Extraction Kit美国 Axygen Biosciences;2%琼脂糖凝胶西班牙 b
9、iowest;FastPfu 聚合酶中国 TransGen;AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒美国 Axygen;其他试剂均为分析纯。ABI GeneAmp 9700 PCR 仪美国 ABI 公司;Nanodrop 2000 超微量分光光度计美国 ThermoFisher Scientific 公司;Thermo Fisher Scientific 台式高速冷冻离心机德国 Sigma 公司;Illumina MiSeqMISEQ 测序仪美国 Illumina 公司;FA1004N 电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;Trace1300-TSQ8000 GC-MS 联用仪美国赛默飞公司;S
10、oilStikpH 计美国 Spectrum 公司;Calorie Answer CA-HM北京盈盛恒泰科技有限责任公司。1.2实验方法 1.2.1 样品采集剁椒萝卜生产工艺:新鲜辣椒清洗混料(萝卜干、食盐、大蒜、生姜)剁碎装罐封口发酵杀菌成品。随机取同一批次经巴氏杀菌后、且未拆封的剁椒萝卜产品,于 37 条件下贮藏模拟后熟。在后熟第 0、3、7 和 14 d 随机各取 3 罐样品混合后分别标记为 D0、D3、D7 和D14。无菌条件取样 10 g,用于 DNA 提取和高通量测序,余下样品储存80 条件下,备用。1.2.2 理化指标测定及感官评价pH 参照 GB5009.237-2016食品安
11、全国家标准 食品 pH 值的测定测定;总酸参照 GB/T 12456-2021食品中总酸的测定中直接滴定法测定,结果以乳酸计。使用卡路里分析仪对能量进行测定。所有实验均重复测定三次。邀请 10 名经专业感官培训后的人士组成评定小组,分别从产品色泽、脆度、风味、滋味进行综合第 44 卷 第 19 期安莲霞,等:剁椒萝卜后熟期微生物多样性与风味品质分析 129 感官评价,采用 100 分评分制。感官评分标准如表 1所示。表 1 剁椒萝卜感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of chopped pepper radish项目评价标准满分色泽辣椒、萝卜干
12、红白相间,色泽鲜艳明亮(1620)分色泽一般,较均匀(1115)分色泽灰暗,不均匀(610)分20脆度辣椒很脆,萝卜干有脆度(1620)分辣椒、有脆度,萝卜干稍有脆度(1115)分辣椒、稍有脆度,萝卜干富有嚼劲(610)分20风味风味自然、保持辣椒、萝卜干原有味道(2130)分风味不突出,辣椒、萝卜干原味过重或过轻(1120)分风味较差,辣椒、萝卜干原味不自然(010)分30滋味鲜辣爽口,酸咸适宜(2130)分酸咸适中(1120)分过酸或过咸(010)分30 1.2.3 总 DNA 提取与 PCR 扩增根据 OMEGA-soil DNA Kit 试剂盒说明书抽提剁椒萝卜样本总DNA,用 Nan
13、oDrop 2000 检测 DNA 浓度和纯度。后进行 PCR 扩增,扩增体系:4 L 5FastPfu 缓冲液,2 L 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 L 引物(5 mol/L),0.4 L FastPfu 聚合酶,10 ng DNA 模板,ddH2O 补足至 20 L。细菌 V3-V4 可变区扩增引物为 338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和 806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3),而 真 菌 以ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)和ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)为 扩增引
14、物,扩增程序:95 预变性 3 min,27 个循环(95 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 30 s),最后 72 延伸 10 min,4 保存。使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物,利用 AxyPrep DNA GelExtraction Kit 纯化,Tris-HCl 洗脱,2%琼脂糖电泳检测。根据 Illumina MiSeq nova6000(Illumina,SanDiego,USA)操作系统规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2300 文库,之后在 Illumina 公司 Miseq PE300平台测序。原始序列使用 QIIME2 DADA2 插件进行质控、去噪、
15、拼接、并去除嵌合体,形成分类操作单元(Operational Taxonomic Unit,OTU)13。接着运用QIIME2 feature-classifier 插件将 OTUs 与 GREEN-GENES(细菌,13.8 版本)、Unite(真菌)分类学数据库按照 99%相似度聚类进行比对,再用 QIIME2 fea-ture-table 插件剔除所有污染性线粒体和叶绿体序列,获得物种分类信息表14。1.2.4 剁椒萝卜挥发性风味物质测定准确称量2.5 g 样品于顶空瓶中,依次加入 7.5 mL 饱和食盐水、20 L 环己酮(20 g/mL),并用 PTFE 硅胶隔膜密封。采用顶空固相微
16、萃取(HS-SPME)进行香气成分富集,在 70 下平衡 15 min,经萃取头顶空吸附40 min,在进样口 240 下解吸 5 min,随后在 GC-MS 上机测定。GC 条件:DB-5MS 毛细管柱(30 m0.25 mm,0.25 m),载气氦气(纯度:99.999%),流速 1 mL/min,不分流模式,进样口温度 240。升温程序:40 保持 5 min,以 5/min 上升到 150,保持 3 min,然后以 5/min 上升至 240,保持 5 min。MS 条件:电子轰击(EI)离子源,电离能为 70 eV,传输线温度 240,离子源温度 250,全扫描范围 35550 A/
17、m,速率 1 scan/s。定性定量分析:原始数据与NIST(https:/webbook.nist.gov/chemistry/)谱库比对鉴定,仅保留匹配度(SI)大于 700 化合物。定量分析采用内标法,按下式计算:Ci=CisAiVAism式中:Ci为任一组分质量浓度(g/kg);Cis为内标质量浓度(g/mL);Ai为任一组分色谱峰面积;Ais为内标色谱峰面积;V 为内标体积(L);m 为样品质量(g)。1.3数据处理所有数据均重复三次实验,结果以平均值标准差(meanSD)表示。SPSS Statistics 26 用于方差分析和邓肯检验,确定 P0.05 为差异显著。使用 orig
18、in96 绘图,SIMCA 14.1 构建 PCA、OPLS-DA 模型。使用 QIIME2 core-diversity、QIIME2 Bray Curtis 插件分别计算特征序列水平 Alpha 多样性指数和 Beta 多样性指数,并用 NMDS 图可视化。通过 R(V 3.6.1)软 件 的“corrplot”包 计 算 Pearson相 关 性 系 数,Cytoscape V 3.8.2 软件用于相关性网络可视化。2结果与分析 2.1剁椒萝卜不同后熟期感官评价及理化指标分析酸味是发酵蔬菜显著滋味特征之一,而总酸和pH 是衡量乳酸发酵食品所含酸味物质的关键指标。如图 1A 所示,剁椒萝卜
19、在后熟阶段中 pH 显著下降(P0.05),从 5.680.02 逐渐降低到 5.390.02;总酸含量显著上升(P0.05)(图 1B),到 D14 时达到 6.080.03 g/kg,其变化趋势与罗凤莲等10研究结果一致。图 1C 中,剁椒萝卜不同后熟阶段能量显著提升(P0.05),说明后熟处理能在一定程度上提高剁椒萝卜风味品质。2.2剁椒萝卜后熟期微生物多样性分析从所有样本中分别获得了 569771 条高质量细菌序列和 438219 条高质量真菌序列,说明所有剁椒萝卜样本均检测到数据集中主要物种15。随着测序深度增加,细菌和真菌稀释曲线(Rarefaction Curve)(图 2A、C
20、)趋向平稳,表明测序数据可用于后续分析。-多样性分析表明(表 2),剁椒萝卜细菌多样性 130 食品工业科技2023 年 10 月指数随着后熟时间延长而增加,并在 D14 达到最大值,表明后熟处理后细菌丰富度增加;但在 D7 阶段有所下降,可能是 D7 样品在烘箱中受热不均、取样时酒精消杀作用等外部因素导致。而真菌中 D3 最高,其他后熟时间变化不显著。此外,所有样本中细菌的 Observed-OTUs 指数均高于真菌,说明较真菌相比,细菌丰富度和多样性更高。02004006000501001500200400600012345605000100001500020000050100150050
21、0010000150002000001234Observed_otusNumber of sequences D0.1 D0.2 D0.3 D3.1 D3.2 D3.3 D7.1 D7.2 D7.3 D14.1 D14.2 D14.3AShannonNumber of sequences D0.1 D0.2 D0.3 D3.1 D3.2 D3.3 D7.1 D7.2 D7.3 D14.1 D14.2 D14.3BObserved_otusNumber of sequences D0.1 D0.2 D0.3 D3.1 D3.2 D3.3 D7.1 D7.2 D7.3 D14.1 D14.2 D1
22、4.3CShannonNumber of sequences D0.1 D0.2 D0.3 D3.1 D3.2 D3.3 D7.1 D7.2 D7.3 D14.1 D14.2 D14.3D图 2 细菌(A、B)和真菌(C、D)稀释曲线和香农指数曲线Fig.2 Bacteria(A,B)and fungi(C,D)rarefaction curves andShannon curves 如图 3 所示,细菌和真菌胁迫系数分别为0.0745 和 0.0001,表明剁椒萝卜不同后熟阶段微生物差异显著。细菌方面,D0、D3 和 D14 样本有聚集,说明它们之间的细菌群落结构相似(图 3A),而真菌中
23、D0 和 D14 样本相对集中。此外真菌和细菌中的 D7 样本均与其他样本分离,表明其群落结构与其他时间点有差异。510152025滋味风味脆度色泽 D0 D3 D7 D14DD0D3D7D145.355.405.455.505.555.605.655.70D0D3D7D144.04.55.05.56.06.5D0D3D7D148090100110120130abcddcbababaabpH后熟时间(d)A后熟时间(d)B能量(kcal)后熟时间(d)C总酸(g/kg)图 1 剁椒萝卜不同后熟阶段 pH(A)、总酸(B)、能量(C)和感官评价雷达图(D)Fig.1 The pH(A),tota
24、l acid(B),energy(C)and sensoryevaluation radar chart(D)at different post-ripening stages ofchopped pepper radish注:图中上标小写字母不同表示差异显著(P0.05)。第 44 卷 第 19 期安莲霞,等:剁椒萝卜后熟期微生物多样性与风味品质分析 131 D0.1D0.2D0.3D14.1D14.2D14.3D3.1D3.2D3.3D7.1D7.2D7.30.500.250.000.250.501.00.50.0NMDS1NMDS2D0D14D3D7Bray_curtis NMDS st
25、ress:0.0745D0.1D0.2D0.3D14.1D14.2D14.3D3.1D3.2D3.3D7.1D7.2D7.30.20.00.20.250.000.250.50NMDS1NMDS2D0D14D3D7Bray_curtis NMDS stress:1e04AB图 3 剁椒萝卜后熟阶段细菌(A)和真菌(B)群落 NMDSFig.3 Bacterial(A)and fungal(B)community NMDS in thepost-ripening stage of chopped pepper radish 2.3剁椒萝卜后熟期微生物群落结构演替分类学分析有助于探明剁椒萝卜后熟期微
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