盾叶薯蓣响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1569-1582盾叶薯响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析王庆婷”，耿晓桐”，李雅静?*，张娟,刘庆普，龚海燕，雷敬卫，谢彩侠1*1河南中医药大学河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心，郑州450 0 46；2信阳农林学院，信阳46 40 0 0；3上海中医药大学，上海2 0 12 0 3摘要：为探讨盾叶薯在低磷胁迫下的生理变化、笛体皂苷类成分代谢及基因表达的响应特征，本研究选取河南南阳产盾叶薯进行模拟低磷胁迫实验，在不同时期对根际基质中的磷含量（全磷、速效磷、磷酸铝盐、磷酸铁盐、磷酸钙盐）和土壤酸性磷酸酶（soil acid phosphatase,S-ACP）活性、植株根系发育特征（总根长、总投影面积、总表面积），各部位过氧化物酶（peroxidase,POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性及留体皂苷类成分含量等指标进行分析,确定盾叶薯响应低磷胁迫的关键时期,并利用RNA-Seq测序对关键时期盾叶薯根茎、叶片、地上茎3个部位中的基因表达特征进行分析。研究发现低磷胁迫处理后盾叶薯根际基质中易吸收态磷含量显著降低,其抗氧化酶(POD、SO D)与酸性磷酸酶活性均显著升高，根系发育受阻;低磷胁迫可明显影响盾叶薯中笛体皂苷的合成与积累，且不同部位响应特征不同；胁迫初期为盾叶薯响应低磷胁迫的关键时期；响应低磷胁迫关键时期的盾叶薯基因表达存在明显的组织特异性,对三个处理组不同部位基因表达量与代谢通路进行分析,分别从盾叶薯根茎、叶片、地上茎3个部位中挖掘到2 39、2 11、2 37 个差异基因，涉及类骨架、有机酸、肌醇的生物合成等多个代谢通路。上述研究结果说明盾叶薯通过改变基因表达水平对表型性状和生理代谢过程进行调节来响应低磷胁迫，本研究为研究盾叶薯响应低磷胁迫的分子机制提供理论依据。关键词：盾叶薯；低磷胁迫;磷形态；土壤酸性磷酸酶；抗氧化酶；笛体皂苷;基因表达中图分类号：R282;R932D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.9.011Physiological metabolism and gene expressin characteristics ofDioscorea zingiberensis C.H.Wright underWANG Qing-ting,GENG Xiao-tong,LI Ya-jing*,3*ZHANG Juan,LIU Qing-pu,GONG Hai-yan,LEI Jing-wei,XIE Cai-xia1*文献标识码：Alow phosphorus stress文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)9-156 9-14Henan Provincial Engineering Technology Research Center for Quality Control and Evaluation of TraditionalChinese Medicine,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 4500462,China;2 Xinyang Agriculture and Forestry College,Xinyang 464000,China;3 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,ChinaAbstract:To investigate the physiological changes,steroidal saponins metabolism and gene expression of D.zingiberensis un-der low phosphorus stress,D.zingiberensis from Nanyang,Henan province was selected to simulate low phosphorus stress.Thephosphorus content(total phosphorus,available phosphorus,aluminophosphate,phosphoric acid iron salt,calcium phosphate)and soil acid phosphatase(S-ACP)activities in rhizosphere matrix,root development characteristics(total root length,totalprojected area,total surface area),peroxidase,superoxide dismutase activities and steroid saponins contents in each tissuewere analyzed at different periods.The key period of D.zingiberensis response to low phosphorus stress was determined,andRNA-seq sequencing was used to analyze the gene expression characteristics in roots,leaves and stems of D.zingiberensis.It收稿日期:2 0 2 3-0 2-0 6基金项目：河南省高等学校重点科研项目（2 0 A360016)*通信作者Tel:86-013673651577;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 6-2 91570was found that the content of absorbable phosphorus in rhizosphere matrix of D.zingiberensis was significantly decreased,theactivities of antioxidant enzymes（PO D,SO D)a n d s o i l a c i d p h o s p h a t a s e (S-A CP)w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d u n d e r l o wphosphorus stress,and root development was inhibited;The synthesis and accumulation of steroidal saponins in D.zingiberensiswere obviously affected by low phosphorus stress,and the response characteristics of different parts were different;The earlystage of stress is the critical period for D.zingiberensis to respond to the low phosphorus stress;The gene expression of D.zin-giberensis in the critical period of low phosphorus stress showed obvious tissue specificity.The gene expression levels and met-abolic pathways in different parts of the three treatment groups were analyzed,and 239,211 and 237 differential genes werefound from the root,leaf and stem of D.zingiberensis,respectively.It involves many metabolic pathways such as terpenoid skeleton,organic acid and inositol biosynthesis.et al.The above research results indicate that D.zingiberensis responded to the low phosphor-us stress by regulating phenotypic traits and physiological metabolic process through changing gene expression level,which providedtheoretical basis for studying the molecular mechanism of D.zingiberensis response to the low phosphorus stress.Key words:Dioscorea zingiberensis C.H.Wright;low phosphorus stress;phosphorus form;soil acid phosphatase;antioxidantenzymes;steroidal saponins;gene expression磷作为植物生长发育所必需的大量元素之一，参与了植物的光合作用、能量转化、信号转导，以及酶活性等的调节，可以提高植物对环境的适应性。植物获取磷素的主要来源为土壤，但由于土壤中的磷转移性差,极易被固定,因此其生物有效性低2 。施用磷肥虽能够缓解有效磷的缺失,但易与土壤中的铁、铝、钙等离子或土壤颗粒结合而难以被植物摄取。此外,过度施用磷肥不仅会加剧磷矿的衰竭,还会造成周围水体富营养化的环境污染问题3-5。因此研究植物低磷胁迫下的响应机制,筛选并培育耐低磷品种迫在眉睫。低磷胁迫下,植物会通过表型性状和生理代谢的调节来响应低磷信号，以改变磷的存在形态,提高植物对磷的吸收率。植物根系通过分泌酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP)提高根际土壤的酸性磷酸酶活性,实现对土壤中难溶性有机磷的活化利用。ACP 是一种能水解单磷酸酯键释放无机磷的水解酶类，一般ACP活性的增高被视为植物响应低磷胁迫的重要机制之二7 。另外,植物的根系发育情况-0 及抗氧化系统1-13 也会产生变化来响应低磷胁迫。在漫长的生长发育过程中,植物自成一套抗低磷的机制。低磷胁迫下,植物会通过改变一系列基因表达水平来调控自身生理生化过程，从而尽快适应低磷环境延长生存时间。转录组测序技术(RNA-Seq)可以研究组织在特定条件下的基因转录情况、定位并注释基因,是研究植物生理过程分子机理的有效手段14。目前RNA-Seq被广泛应用于植物响应外界胁迫的分子机制研究15.16 ，极大推动了植物抗逆分子机制的研究进展。因此利用RNA-Seq研究植物的耐低磷分子机制,对寻找植物响应低磷胁天然产物研究与开发迫的代谢通路进而筛选出响应低磷胁迫的潜在关键基因具有重要意义。盾叶薯（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)为薯科（Dioscoreaceae）薯属植物，俗称黄姜、火头根。盾叶薯为我国特有品种,是世界上薯皂素含量最高的植物。盾叶薯是提取薯皂素重要的药源植物，同时也是合成笛体类激素药物的重要原料17 。除此之外盾叶薯还是治疗心脑血管疾病的临床用药18 ,这极大促进了盾叶薯相关产业的发展。前期研究发现,长期种植盾叶薯后会降低土壤有效磷含量，造成低磷胁迫，导致盾叶薯植株生长发育受阻,影响其笛体皂苷类成分的合成。目前关于低磷胁迫对盾叶薯生长及笛体皂苷代谢的影响还未见报道，因此，本文根据前期实验结果，选取河南南阳产盾叶薯为研究对象，以无机磷分级含量、根系发育情况、根际基质酸性磷酸酶（soilacid phosphatase，S-A CP）活性、植物过氧化物酶（p e r o x i d a s e，PO D）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD)活性、各部位笛体皂苷类成分含量等为评价指标考察低磷胁迫下盾叶薯的生理变化及笛体皂苷类成分的代谢特征,并利用转录组测序技术对关键时期盾叶薯不同组织部位的基因表达特征进行分析,为进一步研究盾叶薯应答低磷胁迫的分子机制提供依据。1材料与方法1.1仪器Agilentl100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）;2 0 0 0 ES型蒸发光散射检测器（奥特奇公司）；1510 型全波长酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；SX2-18-12型马弗炉（苏州江东精密仪器有限公Vol.35Vol.35司）;LA-90型根系扫描仪（苏州信华特检测技术有限公司）;10 10 0 L和10 0 10 0 0 L移液枪（艾本德国际贸易有限公司）。1.2试剂乙睛（安徽天地高纯溶剂有限公司;纯度：HPLC99.9%；生产批号：AS1122-801-22075302）；三角叶薯皂苷、盾叶新苷（成都克洛玛生物科技有限公司；纯度9 8%；生产批号：CHB17051、CHB170718）；薯皂苷、原薯皂苷、伪原薯皂苷（成都曼思特生物科技有限公司;纯度9 8%；生产批号分别为：MUST-17090203、M U ST-17 10 0 9 0 1、MUST-17110504）；甲苯（烟台市双双化工有限公司；纯度9 9.5%；生产批号：2 0 10 12 0 1）；酒石酸锑钾（武汉克米克生物医药技术有限公司；纯度9 9%；生产批号：110 7 1-15-1）；碳酸氢钠（天津市永大化学试剂有限公司；纯度9 9.5%；生产批号：2 0 2 10 50 6）苯酚（天津市瑞金特化学品有限公司；纯度9 9%；生产批号分别为：HG/T4367-2012）；抗坏血酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司;纯度9 9.7%；生产批号：GB/T15347-1994）；土壤酸性磷酸酶（S-ACP）活性检测试剂盒（索莱宝生化试剂盒事业部）；甲硫氨酸（上海源叶生物科技有限公司；纯度9 9%；生产批号：J15J8R39920）；氮蓝四唑（山东西亚化学工业有限公司；纯度9 8%；生产批号：ST362）；核黄素（北京奥博星生物技术有限责任公司；纯度9 8%10 2%；生产批号：2 0 1410 0 8）；愈创木酚（天津市光复精细化工研究所；纯度9 9%；生产批号：B1227012）;M i n i BEST 试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。1.3样品1.3.1植物材料培养与处理以珍珠岩、蛭石(3:1)作为培养基质,进行盆栽试验。试验设计为正常供磷（N）、中度低磷胁迫(H）、重度低磷胁迫（Z)3个处理,每个处理设置重复30 次。正常供磷组以霍格兰完全营养液进行浇灌,中度低磷胁迫组与重度低磷胁迫组分别浇灌中度缺磷营养液（完全营养液中一半的磷含量）与重度缺磷营养液（剔除磷组分的完全营养液,剔除的K用KCl进行补充）。选取大小一致已有芽点的种根,栽种于不同磷处理的盆栽基质中,统一管理。分别在苗龄30 d的胁迫初期（5月30 日，标记为5）、苗龄6 0 d的胁迫中期（6 月30 日，标记为6）、苗龄90d的胁迫后期（7 月30 日，标记为7)进行采样，王庆婷等：盾叶薯响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析1571每次采样10 株。1.3.2样品采集采集盾叶薯新生根茎（R）、地上茎（S）、老根（O）、须根(FR)与叶片（L)后,清洗,用吸水纸吸干后快速用锡箔纸包装,置于液氮中,用于抗氧化酶（SO D、PO D）活性实验；采集盾叶薯根际基质（R M），自然风干后混匀，置干燥器中保存,用于全磷、速效磷、磷酸铝盐（aluminophosphate，A L-P），磷酸铁盐（phosphoric acid iron salt,Fe-P）、磷酸钙盐（c a l c i u m p h o s p h a t e,Ca-P）含量和土壤酸性磷酸酶（S-A CP)活性测定;另采集单株样品,测定其根系发育特征。剩余各处理各部位样品，净制切制后置烘箱中45烘干，粉碎，过4号药典筛,置干燥器中保存,用于盾叶薯各部位笛体皂苷类成分的含量测定，各样品以“部位-采样日期-处理方式”的方式命名,如名称为S-5-Z的样品代表5月30 日采集的重度低磷胁迫处理组的地上茎。1.4木根际基质中各级磷含量测定根际基质全磷的测定方法参照国家标准土壤全磷测定法中的氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法；采用0.5mol/LNaHCO，法测定速效磷含量19 ；无机磷（Al-P、Fe-P、Ca-P)测定方法参照Huang 等2 0 分级磷测定方法；根际基质的磷含量利用统计学方法对其进行分析。1.5根际基质中酸性磷酸酶(S-ACP)活性测定称取风干混匀的根际基质0.1g,加人0.0 5mL甲苯溶液,轻摇15min,加0.4mL试剂1摇匀后,置于37 恒温培养箱,开始计时,催化反应2 4h;到时间后迅速加人1mL试剂2 充分混匀,终止催化反应。10 0 0 0 r/min室温离心10 min，取上清液10L,加人2 0 L试剂3、4L试剂4,充分混匀,显色后再加16 6 L蒸馏水，混匀后于室温下静置30min,在6 6 0 nm处测定吸光度;空白管与标准管分别以10 L蒸馏水和10 L0.5mol/mL苯酚标准液替换提取液测定吸光值。以37 下中每克土壤每天释放1 mol 酚为一个酶活力单位,根际基质的ACP活性结果利用统计学方法对其进行分析。计算公式如下：ACP(U/g)=0.725（O D 测定-OD空白）（OD标准-OD空白）W式中，W为根际基质的质量1.6盾叶薯根系发育测定利用根系扫描仪对不同处理不同时期下盾叶薯1572的须根进行扫描,得到总根长、总投影面积与总表面积,并利用统计学方法对其进行分析。1.7盾叶薯不同部位抗氧化酶（SOD、PO D）活性测定SOD活性采用氮蓝四唑光化还原法测定,POD活性采用愈创木酚法测定,实验方法参考 Li21实验指导中的测定方法,并利用统计学方法对其进行分析。1.8盾叶薯不同部位笛体皂苷类成分含量测定1.8.1色谱条件Athena Cis色谱柱(4.6 mm 250 mm,5 m);天然产物研究与开发流速1.0 mL/min;柱温30；流动相为乙（A）：水(B)梯度洗脱(0 5 min,15%A25%A;5 6min,25%20%A;6 12 min,20%30%A;12 14min,30%34%A;14 15 min,34%37%A;15 20 min,37%38.6%A;20 25 min,38.6%60%A;25 30 min,60%70%A;30 40 min,70%100%A）;进样量5L。蒸发光散射检测器（ELSD)参数：气体流量2.5L/min,漂移管温度115,增益值为2。盾叶薯笛体皂苷类成分对照品（A）与供试品(B)的HPLC图见图1。AVol.352410B20时间Time（mi n）303404510图1盾叶薯笛体皂苷类成分对照品（A）和供试品（B)的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance（A)a n d t e s t s u b s t a n c e (B)o f s t e r o i d a l s a p o n i n s i n D.z i n g i b e r e n s i s注：1.原薯皂苷；2.伪原薯皂苷；3.盾叶新苷；4.三角叶薯皂苷；5.薯皂苷。Note：1.Pr o t o d i o s c i n;2.Ps e u d o p r o t o d i o s c i n;3.Zi n g i b e r e n s i s1.8.2对照品溶液和供试品溶液的制备对照品溶液的制备：分别精密称定一定量的原薯皂苷、伪原薯皂苷、盾叶新苷、三角叶薯皂苷、薯皂苷对照品样品置于10 mL容量瓶中,用甲醇（色谱纯）溶解并定容制成浓度分别为0.6 7 6、0.39.0.75、0.42 5、0.37 8 m g/m L的对照品储备液，经0.2 2 m微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。供试品溶液的制备：精密称取盾叶薯样品0.5g置于具塞锥形瓶中，加人9 0%乙醇30 mL,8520时间Time（mi n）newsaponin;4.Deltonin;5.Dioscin.加热回流2 h,冷却至室温，用9 0%乙醇补足失重,滤纸过滤,取续滤液2 0 mL置于蒸发皿中,挥干，用甲醇（色谱纯）溶解并定容至5mL容量瓶，经0.22 m微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。1.8.3方法学考察1.8.3.1线性关系将5个对照品分别稀释后按照“1.8.1”项下色谱条件测定其峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线（见表1）。5种皂3040Vol.35王庆婷等：盾叶薯响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析1573表15种皂苷类成分的标准曲线及线性范围Table 1Standard curve and linear range of five saponin成分Component原薯皂苷Protodioscin伪原薯皂苷Pseudoprotodioscin盾叶新苷Zingiberensis newsaponin三角叶薯皂苷Deltonin薯皂苷Dioscin线性回归方程Linear regression equationy=1.610 8x+3.430 1y=1.532 9x+2.512 2y=1.493 8x+3.555 4y=1.091 0 x+3.002 9y=1.315 7x+3.319 7线性范围Linear range(mg/L)0.999 225.00 350.000.999 4130.00 780.000.999 0386.00 1 930.000.999 011.04 276.000.999 114.88 186.00苷类成分在各质量浓度范围内均呈现良好的线性关系。1.8.3.2精密取同一样品，按“1.8.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进行重复性、稳定性及精密度实验，结果表明各试验的RSD均符合要求，因此该仪器的精密度和方法重复性良好,样品在2 4h内稳定性良好。1.8.3.3加样回收率试验精密取同一样品6 份，每份0.2 5g，分别精密加人适量原薯皂苷、伪原薯皂苷、盾叶新苷、三角叶薯皂苷、薯皂苷混合对照品溶液适量，按“1.8.2”项下方法制备。按“1.8.1”项下色谱条件进样,测定原薯皂苷、伪原薯皂苷、盾叶新苷、三角叶薯皂苷、薯皂苷的含量,计算平均加样回收率与RSD,结果表明原薯皂苷、伪原薯皂苷、盾叶新苷、三角叶薯皂苷、薯皂苷的平均加样回收率分别为9 8.38%、9 9.32%、9 7.6 8%、10 2.33%、100.41%,RSD分别为2.38%、2.41%、2.40%、2.69%、1.7 7%,说明该方法可以准确测定盾叶薯中5种笛体皂苷类成分的含量。1.8.4样品测定按上述建立的方法测定盾叶薯各部位笛体皂苷类成分的含量，每个样品重复3次，测定结果取其平均值,并利用统计学方法对其进行分析。1.9盾叶薯不同部位响应低磷胁迫关键时期的基因表达特征分析1.9.1盾叶薯不同部位的转录组测序及组装选择5月30 日（胁迫初期）不同处理下盾叶薯的新生根茎、地上茎、叶片进行转录组分析。用MiniBEST试剂盒进行柱式法提取盾叶薯3个部位的总RNA,通过NanoDrop和Agilent 2100系统检测得到的总RNA浓度和完整性,利用提取的样品总RNA构建文库。重复性、稳定性及精密度试验采用BGISEQ-500平台测定转录组样本,由测序所得的数据称为raw reads。r a w r e a d s 去污染、去接头后得到clean reads，使用Trinity对合格的cleanreads 进行组装,然后使用Tgicl 对转录本进行聚类去允余得到Unigene。1.9.2盾叶薯不同部位的基因表达量统计、差异基因筛选、GO注释及KEGG功能分析利用SOAP和LASTZ软件计算各基因的表达量,用FPKM表示。参照Audic等2 2 基于测序的差异基因检测方法，根据基因的表达量（FPKM值）计算该基因在不同样本间的差异表达倍数,筛选出样品间的差异表达基因（DEGs）。在分析中,差异表达基因默认定义为错误发现率（false discovery rate，FDR)小于等于0.0 5且倍数差异在2 倍以上的基因2 3。根据DEGs 进行CO数据库比对和KEEN 代谢通路定位分析，通过几何检验筛选差异最显著富集的前2 0 个通路。2结果与分析2.1盾叶薯响应低磷胁迫的生理变化特征2.1.1不同处理各时期根际基质中各级磷含量和酸性磷酸酶(S-ACP)活性分析从不同处理各时期根际基质中各级磷含量及酸性磷酸酶(S-ACP)活性的测定结果（见图2）上可看出,随着低磷胁迫程度的增加,盾叶薯根际基质中各级磷含量呈下降趋势。盾叶薯根际基质的速效磷含量和Ca-P在低磷胁迫过程中其含量变化不大，且各处理组速效磷含量之间的差异无统计学意义；Al-P与Fe-P作为土壤中较为活泼的磷形态,在各处理组间的含量差异较大，其含量均呈阶梯状下降趋势,根际基质中Al-P含量对低磷胁迫的响应程度大1574于其他磷。由盾叶薯根际基质中 S-ACP活性可知,胁迫初期和中期S-ACP活性均高于胁迫后期。整个胁迫过程中重度胁迫组根际基质中的S-ACPA0.4000(%)0.35000.30000.25000.20000.1500知0.0000D0.00600.0050-0.0040-0.0030-0.00100.0000Fig.2 Content of total phosphorus（A),a v a i l a b l e p h o s p h o r u s (B),A L-P（C),Fe-P（D),Ca-P(E)a n d a c t i v i t y o f注：同一采样时期内不同小写字母表示各磷胁迫组之间差异显著。Note:In the same samplingdate,different lowercase letters indicate significant2.1.2不同处理各时期盾叶薯的根系发育情况根系发育情况表明（见图3），重度胁迫组的须根明显稀少且呈细长状,根茎发育迟缓；胁迫中期3个处理组间的须根发育特征差异性不明显，根茎均可以发育，但重度胁迫组根茎萌发点数目相对较少；胁迫后期胁迫组处理下的须根变黄，而正常组的变化不明显,且正常组的根茎萌发点较多。根系扫描结果表明（见图4），胁迫初期重度胁迫组盾叶薯的总投影面积与另外两组之间的差异存在统计学意义。总体来看,胁迫初期3个处理之间的根系发育差异性大于胁迫中后期。2.1.3不同处理各时期盾叶薯各组织部位抗氧化酶(SOD、PO D)的活性分析不同处理不同时期盾叶薯5个组织部位的SOD活性和POD活性变化结果表明（见表2），各处理之间盾叶薯SOD及POD活性的变化呈现一定的规律性。盾叶薯各组织部位中POD的活性对天然产物研究与开发活性最高,在胁迫前期和胁迫后期其 S-ACP活性与正常组之间的差异存在统计学意义。BCNHZ56采样日期Samplingdate56采样日期Samplingdate图2不同处理各时期盾叶薯根际基质中的全磷（A）、速效磷（B）、A L-P(C）、Fe-P(D)、Ca-P(E)含量及 S-ACP(F)的活性S-ACP（F)i n r h i z o s p h e r e ma t r i x o f D.z i n g i b e r e n s i s i n d f f e r e n t t r e a t me n t s a n d s t a g e sdifference among phosphorus stress groups.Vol.350.000400.04000.000350.03500.00030(%)0.0300nou0.00025isoqd0.000200.000150.0001030.000530.0000E0.0200NHZ7NHZ0.0250-0.02000.01500.005056采样日期Samplingdate0.0180-(%)0.0160-0.01400.01200.01000.00800.00600.00400.00200.0000号70.0000F16.00NH56采样日期Samplingdate低磷胁迫的响应程度大于SOD,在整个胁迫过程中,盾叶薯5个组织部位各胁迫组的POD活性整体上高于正常组,其中新生根茎表现最为明显。差异性分析表明,在胁迫过程中盾叶薯5个组织部位各组之间的SOD活性差异在统计学上未达显著水平,新生根茎各胁迫组以及地上茎重度胁迫组的POD活性与正常组之间的差异在统计学上达显著水平,另外,各组织部位胁迫组与正常组POD活性存在差异的表现时期不同,其中,老根主要表现在胁迫后期,须根主要表现在胁迫初期和中期,而叶片主要表现在胁迫初期和后期。2.2不同处理各时期盾叶薯各部位笛体皂苷类成分的含量特征分析盾叶薯新生根茎（R）、茎部（S）、老根（O）、须根（FR）、叶片（L)中5种笛体皂苷的含量测定结果表明（见图5），笛体皂苷类成分在盾叶薯植株中的分布表现出明显的组织特异性,其中新生根茎和514.00B/n)12.0010.008.006.004.00-2.000.007756采样日期SamplingdateNH7Vol.35王庆婷等：盾叶薯响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析1575H-5N-5H-6N-6H-7N-5图3不同处理各时期盾叶薯的根系发育情况Fig.3Root development of D.zingiberensis in different treatments and stagesA1200.001000.00-800.00-600.00400.00-200.000.00Fig.4 Total root length(A),total projected area(B)and total surface area(C)of D.zingiberensis in diferent treatments and stages注：同一采样时期内不同小写字母表示各磷胁迫组之间差异显著。Note:In the same sampling date，d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t分类ClassificationR-5R-6R-7S-5S-6BN日(uo)Z25.00-20.00-15.0010.005.00-56采样日期Samplingdate图4不同处理各时期盾叶薯须根的总根长（A）、总投影面积（B）、总表面积（C)difference among phosphorus stress groups.表2不同处理各时期盾叶薯5个组织部位的SOD、PO D 活性Table 2SOD and POD activity in five tissue parts of D.zingiberensis in different treatments and stagesN792.48632.031 943.941 423.151 619.60CN30.00HZ70.00SOD活性SOD activity(U/g FW)H863.84689.101 342.69*1 791.831 607.6845.0035.0030.0025.0020.0015.0010.005.00-56采样日期SamplingdateZ822.20805.621583.271 527.361 635.18NHZ0.005POD活性POD activity(U/g FW)NH2.050.004 875.00*412.501 754.17*65.001 783.33*135.001 060.00280.00510.006采样日期SamplingdateZ2.918.75*2.912.50*2.745.83*565.00*1 370.00*1576续表 2(Continued Tab.2)分类ClassificationS-70-50-60-7FR-5FR-6FR-7L-5L-6L-7注：与正常组相比，*P0.05。Note:Compared with normal group,*P 0.05.老根中均检测到原薯皂苷、伪原薯皂苷、盾叶新苷、三角叶薯皂苷、薯皂苷5种皂苷，地上茎中检测到原薯皂苷和盾叶新苷2 种皂苷,须根中检测到原薯皂苷、伪原薯皂苷、薯皂苷3种皂苷，叶片中检测到伪原薯皂苷、盾叶新苷和三角叶薯皂苷3种皂苷。另外，各组织部位对低磷胁迫的响应特征存在差异，由差异性分析结果可知胁迫A4530252015105-0N天然产物研究与开发SOD活性SOD activity(U/g FW)N1 448.15933.18932.19724.07460.81545.03724.071 404.991 792.111 448.15Vol.35POD活性POD activity(U/g FW)HZ1 943.941 088.37546.91630.62688.16502.14971.971 027.93490.05622.28785.63*570.32971.97724.071 511.221 648.421 675.071.596.511 943.941.583.27初期盾叶薯胁迫组老根、须根、叶片中笛体皂苷含量明显低于正常组，而新生根茎与地上茎中皂苷含量整体高于正常组。胁迫初期盾叶薯不同处理不同部位笛体皂苷类成分含量差异较大，而胁迫中后期整体差异减小,其中根茎对低磷胁迫的响应程度大于其他组织部位。B韩电春Dioscin35三角叶薯电春Deltonin盾叶新Zingiberensis newsaponin原薯装皂Pscudoprotodioscin原馨粮皂管ProtodioscinN366.67450.0081.25233.331 500.00908.33420.83845.00987.501 337.503025201510H425.00825.00290.00633.33*1 395.831 404.17780.002 100.00*1 330.003 516.67*装精皂书Dioscin三角叶薯横皂香Deltonin酒叶新Zingiberensisnewsaponin6原馨预电Pscudoprotodioscin原馨预电ProtodioscinZ983.33*962.50187.50591.67*6 850.00*1 750.00*1 108.331 825.00*1 204.173 850.00*C30(a/8tu)252015薯装皂售Dioscin三角叶薯撕皂售Deltonin居叶新Zingiberensisnewsaponin伪原薯莉皂电书Pscudoprotodioscin原馨莉皂书Protodioscin图5不同处理时期盾叶薯不同部位5种笛体皂苷的含量Fig.5Contents of five steroid saponins in rhizome of D.zingiberensis in different treatments and stages注：A.胁迫初期;B.胁迫中期;C.胁迫后期。Note:A.Early stage of stress;B.Middle stage of stress;C.Late stage of stress.Vol.