乏情期发情绵羊卵巢miRNA及相关靶基因筛选.pdf
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1、第 41 卷 第 5 期2023 年 10 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.5Oct.2023收稿日期:2023-02-05 基金项目:国家自然科学基金项目(32160770)作者简介:谢梦婷(1997),女,硕士研究生,专业方向为动物遗传育种与繁殖研究。通信作者:赵宗胜(1969),男,教授,博士生导师,从事动物遗传育种与繁殖研究,e-mail:zhaozongsh 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.041文章编号:1007-7383(2023)0
2、5-0545-10乏情期发情绵羊卵巢 miRNA 及相关靶基因筛选谢梦婷,解一凡,朱梦婷,南颖,方晨辉,江白慧,齐行东,赵宗胜(石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832000)摘要:目的 筛选、鉴定绵羊卵巢差异 MicroRNA(miRNA)并研究其调控机制,为绵羊非繁殖季节发情的研究奠定基础。方法 使用 Solexa 测序技术进行筛选和分析,对发情和乏情绵羊卵巢,差异 miRNA 的数量和特征进行鉴定,通过实时荧光定量 PCR 进行检测。还进行了对 miR-200c 靶基因检测、GO 注释和 KEGG 信号通路富集等的研究工作。并通过 TargetScan 技术、RNAhybrid 技术
3、等,成功找到了 MAPK8-3端非翻译区(3UTR)与 miR-200c 的潜在互补结合位点,PCR 扩增 MAPK8(丝裂原活化蛋白激酶 8)基因的 3UTR 序列,并成功实现了在 psiCHECK2 的克隆,成功建立了 MAPK8 野生型/突变型重组的双荧光素酶报告质粒。接着把野生型 psiheck2-MAPK8-3UTR/突变型psiheck2-MAPK8-mut3UTR 的质粒,与 miR-200c mimics/mimics-NC,转染至 HEK 293T 细胞中,从而通过双荧光素酶的系统,测定双荧光素酶的生物活性。结果 建立了 OAN(乏情)和 OEN(发情)非繁殖季节绵羊卵巢文库
4、。鉴定出 113 个差异 miRNA,9 个为已知 miRNA,104 个为未知 miRNA。在已知 miRNA 中有 6 个 miRNA 显著(P0.05)上调、3 个下调,其中上调倍数最高的为 miR-200c。在 104 个未知的 miRNA 中,有 52 个 miRNA 显著(P0.05)上调,52 个显著(P0.05)下调。获得候选新 miRNA 的长度分布主要集中在 21 23 nt 之间。荧光定量证实,miRNA 表达的趋势与测序结果一致。用软件预测到 miR-200c 的 27 个靶基因。GO 注释发现 miR-200c 在卵巢组织中介导细胞增殖、迁移、凋亡等过程。KEGG 分
5、析表明,miR-200c 的靶基因涉及发情相关途径(MAPK 信号途径、胰岛素信号通路和 GnRH 信号途径)以及与卵泡/黄体发育相关的途径,MAPK 通路是富集基因最多的通路,共有 25 个基因被富集。干扰 miR-200cmimics,会引起 MAPK8 基因的 Wt 型质粒的荧光表达明显减少(P0.05),而 Mut 型则没有明显改变。结论 筛选出非繁殖季节发情差异显著(P0.05)的 miRNA 有 6 个。试验研究初步证实了 miR-200c 与MAPK8 的靶向关系,开展了 miRNA 家族调节绵羊非繁殖季节发情的试验,为深入研究其调控绵羊繁殖及卵泡发育机制提供了试验基础。关键词:
6、绵羊;卵巢;非繁殖季节发情;miR-200c;MAPK8中图分类号:S813文献标志码:AScreening and preliminary verification of miRNA related to estrus in sheep during the non-breeding seasonXIE Mengting,XIE Yifan,ZHU Mengting,NAN Ying,FANG Chenhui,JIANG Baihui,QI Xingdong,ZHAO Zongsheng(College of Animal Science and Technology,Shihezi Uni
7、versity,Shihezi,Xinjiang 832000,China)Abstract:Objective Screening and identification of microRNAs(miRNAs)in sheep ovaries and studying their regulatory mechanisms laid the foundation for the study of sheep estrus in the non-breeding season.Methods Screening and analysis using Solexa sequencing tech
8、nology to identify the number and characterisation of differential miRNAs,by real-time fluorescence quantitative PCR,in oestrus and estrus sheep ovaries.Work was also carried out on miR-200c target gene detection,GO annotation and enrichment of the KEGG signalling pathway.The potential complementary
9、 binding site of MAPK8-3-end untranslated region(3UTR)and miR-200c was suc-cessfully found by TargetScan technology and RNAhybrid technology,and the 3UTR sequence of MAPK8(mitogen-activated protein kinase 8)gene was PCR amplified and cloning in psiCHECK2 was successfully achieved,and a dual lucifera
10、se reporter plasmid for MAPK8 wild-type/mutant recombination was successfully established.The plasmid of wild-type psiheck2-MAPK8-3UTR/mutant psi-546 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷heck2-MAPK8-mut3UTR,with miR-200c mimics/mimics-NC,was then transfected into HEK 293T cells,thereby measuring the bi-ological acti
11、vity of the dual luciferase by a dual luciferase system.Results A library of OAN(absence)and OEN(estrus)non-breed-ing season sheep ovaries was established.113 differential miRNAs were identified,9 were known miRNAs and 104 were unknown miR-NAs.Six of the known miRNAs were significantly(P0.05)up-regu
12、lated and three were down-regulated,with the highest up-regula-tion fold being miR-200c.Of the 104 unknown miRNAs,52 were significantly(P0.05)up-regulated and 52 were significantly(P0.05)down-regulated.The length distribution of the obtained candidate new miRNAs was mainly concentrated in the range
13、of 2123 nt.Fluorescence quantification confirmed that the trend of miRNA expression was consistent with the sequencing results.The software was used to predict the 27 target genes of miR-200c.GO annotation revealed that miR-200c mediates cell proliferation,migration,and apoptosis in ovarian tissue.K
14、EGG analysis showed that the target genes of miR-200c were involved in estrus-related pathways(MAPK signalling pathway,insulin signalling pathway and GnRH signalling pathway)and pathways associated with follicular/luteal development,with the MAPK pathway being the most enriched pathway with a total
15、of 25 genes enriched.Interfering with miR-200cmimics caused a significant decrease in fluorescent expression of the Wt-type plasmid of the MAPK8 gene(P0.05),while the Mut-type was not significantly altered.Conclusion Six miRNAs were screened for significant(P0.05)differences in non-breeding season e
16、strus.The experimental study initially confirmed the targeting relationship between miR-200c and MAPK8,and carried out ex-periments on the miRNA family regulating estrus in sheep during the non-breeding season,providing an experimental basis for an in-depth study on its mechanism of regulating repro
17、duction and follicle development in sheep.Key words:sheep;ovary;non-breeding season estrus;miR-200c;MAPK8绵羊的生殖功能受到光周期的强烈影响,从乏情到发情的转变通常发生在夏末或初秋,而发情周期在冬末或初春停止1。随着繁殖季节开始,绵羊卵巢上卵泡的发育也呈现周期性变化2。绵羊的季节性发情直接影响生产效率和经济成本,对养羊业及羊肉的产量有重大的影响3。季节性发情是动物繁殖力的关键限制因素,它涉及卵巢生物学和激素分泌在不同季节的变化。因此,对卵巢周期性变化相关机制的研究来提高发情率在养羊业中是非常
18、重要的。以往的研究表明,miRNAs 在卵巢生物学中起着重要的调节作用。为了解 miRNA 介导的转录后调控在绵羊季节性发情中的作用,利用 Solexa 测序技术分析了绵羊发情间期和繁殖季节卵巢 miRNA表达模式的变化。MicroRNA(miRNA)是长度为 22 24 nt 的短RNA 序列,通 过 在 转 录 后 水 平 抑 制 转 录 或 下 调mRNA 来调节基因表达,可以由单独的基因编码或嵌入蛋白质编码基因的内含子或外显子区域,然后转录为单基因或多顺反子簇形成茎环二级结构4。成熟的 miRNA 通过与 mRNA 3 或 5 UTR的种子序 列(7 8 nt)互 补 碱 基 对 结
19、合,抑 制 了mRNA 的 翻 译,从 而 导 致 了 mRNA 的 降 解5。miRNA 也可以通过增强基因表达,在机体内针对细胞增殖分化、激素分泌和肿瘤细胞迁移等过程进行有 针 对 性 的 调 控6。此 外,最 新 研 究 表 明,miRNA 对于生殖细胞分化和生殖系统的发育是必不可少的7。近年来大量研究证实卵巢组织富含的多种稳定miRNA 可直接调控卵泡发生、排卵、黄体发育、黄体退化、激素分泌等过程8。苏倩等9发现 hsa-miR-200c-3p 广泛的参与人类生命活动和疾病过程,与癌症的发生和发展密切相关。研究表明,miR-200c在原始生殖细胞分化过程中表达逐渐降低10。丝裂原活化蛋
20、白激酶 8(Mitogen-activated protein ki-nase 8,MAPK8)表达异常,与多种常见肿瘤(如肝癌、口腔癌等)的发生发展 密切相关11-12。Wang等13在研究抑制 MAPK8 后,生殖相关基因的表达受到明显抑制,MAPK8 的敲除/过表达可以通过抑制/激活 JNK 信号影响胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)的分化。Nan 等14研究发现,miR-200c的表达,明显地减少了卵巢颗粒细胞中,MAPK8 的表达量,但同时也间接调控了其他与卵泡成熟相关基因的 过 表 达,从 而 更 有 效 地 控 制 了 卵 泡 成 熟。Cheng 等15
21、研究结果表明 Mapk8 基因能提高卵母细胞的成熟。本试验在乏情季节中,利用 Solexa 的检测方法,研究了发情及不发情绵羊卵巢中,miRNA 家族的表达量。通过筛选绵羊卵巢中的关键差异 miRNA、GO注释、KEGG 信号通路分析等,注释到了 MAPK 通路等关键通路,通过使用预测程序,检测到了 miR-200c 的靶基因 MAPK8 基因,通过双荧光素酶报告系统验证 miR-200c 和 MAPK8 之间的互相作用,对于明确卵巢中差异 miRNA 家族,以及调控绵羊季节性繁殖的分子机理,都有着重要意义。第 5 期谢梦婷,等:乏情期发情绵羊卵巢 miRNA 及相关靶基因筛选547 1 材料
22、与方法1.1材料1.1.1试验动物及样品采集于非繁殖季节(56 月)在石河子大学动物实验站选择年龄 2 3 岁、体重相近、健康状况良好的经产哈萨克母羊。每日 08 30 和 16 00 进行公羊试情,将公羊引入绵羊圈中,监测发情率。发情特征:绵羊首次接受公羊爬跨、阴道泛红和生殖器肿胀。选择 3 只处于发情后期的绵羊,人工宰杀采集卵巢。同时选 3 只未发情绵羊,屠宰收集卵巢。卵巢样本立即冷冻在液氮中,分别提取总 RNA。1.1.2主要试剂及仪器Trizol 购 自 赛 默 飞 公 司,Agilent BioAnalyzer 2100 购自美国 Agilent 公司,NotI 和 XhoI 及 L
23、ipo-fectamine 2000 购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司,连接酶 T4、miRcute miRNA 荧光定量试剂盒均购自上海 TIANGEN 生物有限公司,HEK 293 T 细胞购 自 Shanghai Cell Bank,大 肠 杆 菌 DH5 购 自Sangon Biotech 公司,质粒 psiCHECK2 购自 Promega公司,Opti-MEM 购自 Gibco Life Technologies 公司,miR-200c mimics 及相应的阴性对照物内参 mimics-NC 购自 Ribobio 公司。实时荧光定量 PCR 仪(R
24、oche LightCycler 96)购自 Roche 公司;紫外分光光度计购自 NanoDrop 公司;酶标仪购自美国 Tecan 公司;凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司。1.2方法1.2.1总 RNA 提取 先提取绵羊卵巢总 RNA,并进行琼脂糖凝胶电泳,以检测其完整性。再利用 Nanodrop ND-2000 分析仪,测定绵羊卵巢 RNA 的浓度、D260 和 D280 nm值。最后,使用 Agilent BioAnalyzer 2100,对样品进行质量检测。1.2.2高通量测序及文库构建使用 6 个经过合格检测的绵羊卵巢样品,进行miRNA 文库构建和高通量测序,该过程由中国北京
25、基因组研究所完成。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE),从 绵 羊 卵 巢 RNA 中 分 离 出 15 30 nt RNA,并将其进行纯化,最后将其连接到 3和 5接头上,以获得更准确的结果。经纯化后送进行 Illumina Solexa 测序,使用 HiSeq2000 平台测序构建 OAN 和OEN 文库。每个样品需要使用 3 g 的总 RNA。第一步,利用 SRNA 的特殊构造,在 SRNA 的 3和 5末端添加剪接。第二步,再以总 RNA 作为模板,进行反转录,得到目标 cDNA。第三步,再利用 PCR 扩增技术和 PAGE 凝胶电泳技术,分离出目标 DNA 片段,并通过凝胶切除方法,
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