多能干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展.pdf

Chinese Journal of Biomedical Engineering2023年8 月August2023中医No.4生国Vol.42报程物学学42卷4期多能干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展李艳伟1*单威刘丽黄琼大方三华1（浙江大学医学院公共技术平台，杭州310058)2（浙江大学基础医学院，杭州310058)摘要：造血干细胞（HSC)移植是血液系统疾病最有效的治疗手段。现阶段,同种异体HSC移植和同种自体HSC移植已在临床被广泛采用，但仍存在不少难题，,如：异基因移植物抗宿主发病（GVHD）难题，以及自体HSC移植数量限制等。多能干细胞（PSC)具备在体外自主更新的潜力，多向分化和形成人体所必需的HSC,PSC包含诱导多能干细胞（iPSC）和胚胎干细胞（ESC）。由于不清楚PSC向HSC分化的内在调节机制和外在调节机制，导致PSC向HSC诱导分化的效率低下,且难以获得机体自身造血功能的HSC等。为此，综述PSC造血分化过程的研究进展。以小鼠体内胚胎造血发生为切人点，利用体外PSC造血分化研究平台，阐述PSC向HSC的内源性分子调控事件，包括转录因子和信号通路介导的造血调控；外源性分子调控事件，包括基质细胞、细胞因子以及新型生物材料等参与的造血调控。同时指出PSC向HSC/HSPC功能移植应用存在问题，为PSC向HSC体外分化研究，为实现PSC来源的HSC以及下游血液细胞的临床转化应用提供依据关键词：造血干细胞；多能干细胞；造血分化中图分类号：R318文献标志码：A文章编号：0 2 58-8 0 2 1(2 0 2 3)0 4-0 50 2-11Advances in the Research on Induced Differentiation of Pluripotent Stem Cellsinto Hematopoietic Stem Progenitor CellsLi YanweilShan Wei?Liu LilHuang Qiong1*Fang Sanhua(Core Facilities,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)(School of Basic Medical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)Abstract:Hematopoietic stem cells(HSC)transplantation is an effective means for the treatment of varioushematological diseases.At present,allograft and autologous HSC transplantation are widely used in clinicalpractice,but there are still many problems,such as graft-versus-host disease caused by allogeneictransplantation,the limited number of HSC for autologous HSC transplantation.Pluripotent stem cells(PSC)including embryonic stem cells(ESCs)and induced pluripotent stem cells(iPSCs)have the ability of self-renewal and multidirectional differentiation in vitro,which theoretically continuously produce HSC.However,there are still key scientific problems to be solved in the study of PSC hematopoietic differentiation,such as lowefficiency in hematopoietic differentiation and difficulties to obtain PSC derived HSC that has long-termhematopoiesis potential in vivo.The reasons are that the internal regulation mechanism and external environmentfor PSC hematopoietic differentiation has not clear yet.This article reviewed the role of internal regulatoryelements including transcription factors and signaling pathways,and external microenvironmental factorsincluding stromal cells,cytokines and novel biomaterials in regulating PSC hematopoietic differentiation duringin vitro and in vivo embryonic hematopoietic development,providing a theoretical basis for the study of PSChematopoietic differentiation in vitro and clinical transformation of PSC-derived HSC.Key words:hematopoietic stem cell(HSC);pluripotent stem cell(PSC);hematopoietic differentiationdoi:10.3969/j.issn.0258-8021.2023.04.012收稿日期：2 0 2 2-0 8-0 4，录用日期：2 0 2 3-0 1-0 3基金项目：浙江大学实验技术研究项目（SYB202130）；浙江省公益分析测试基金（TCC23C070005）*通信作者（Correspondingauthor），E-ma i l：l y w e i z j u.e d u.c n503李艳伟，等：多能干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展4期引言现阶段，同种异体和自体的造血干细胞（h e ma t o p o i e t i c s t e mc e l l，H SC）移植技术虽普遍用于临床治疗，但常会引起异基因移植物抗宿主发病（g r a f t-v e r s u s-h o s t d i s e a s e，G VH D）,难以从患者骨髓中获得充足比例的HSC来实现最佳状态的HSC移植效果 。因此，寻找体外且可替换HSC 的细胞类型是目前造血干细胞在临床治疗应用领域的关键。目前多能干细胞（pluripotent stemcell，PSC）可体外分化成任意体细胞，包含造血干细胞和下游任何血细胞种类，给HSC在再生医学的应用上提供了前景。由于PSC向HSC分化的内在调节机制和外在调节微环境不明确，难以体外诱导PSC分化得到人体具备自身造血功能的HSC2,并且体外诱导分化效果较差。虽有报道通过畸胎瘤和转录调控方式可获取HSC,但畸胎瘤造血存在安全隐患以及效率低等问题，而转录因子介导的PSC分化HSC同样也面临诱导分化效率低下、基因修饰的可靠性、实验的可重复性等问题，因此呕需一种可获取具备移植潜力的HSC的高效率途径，从而保障HSC应用临床治疗 3-41体内造血的发育途径小鼠体内造血发展进程中，内源性调节因子（如信号通路、转录因子）和主血管-性腺区-中肾（a o r t a-g o n a d o-me s o n e p h r o s，A G M）、胎肝（fetal liver,FL）、肝脏和骨髓微环境等外在的微观环境，为体外进行研究PSC的造血分化过程提供了物质基础 5-6 。人体生长发育过程中，原肠胚的诞生标志着人体造血机能诞生的开端，之后逐步分化成拥有内皮功能和造血分化潜力的血管内皮生长因子受体(kinase inert domain-containing receptor,KDR）中胚层细胞,继而生成了血岛和血管腔。在卵黄囊（y o l k s a c，YS）部位产生的第一批原生造血祖细胞，可发育成有核红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。在YS部位产生的第二批的原始造血祖细胞，可产生下游髓系血细胞和成熟红细胞 7 。在AGM区内产生具备长期造血功能的真正成体HSC细胞，待运动到骨髓,使骨髓成为体内造血机能的最终部位 8 。另一个造血途径在背部的主血管部位有大量生血内皮细胞（hemogenic endothelium cells，H E c e l l s）可生长发育为造血细胞 。因此，体内造血发育途径为原肠胚-KDR+中胚层-HE细胞-造血细胞，骨髓为造血机能最终部位，内源性调节因子和外在微环境将为PSC的造血分化提供了参考，为研究体外PSC分化为HSC奠定基础。2PSC向造血干祖细胞分化的研究方法目前体外模拟体内造血发育的过程，使PSC分化为HSC的研究主要有3种方法，分述如下。2.1内源性调节因子调控PSC向HSC分化的研究2.1.1转录因子对调控PSC向HSC分化过程现阶段，PSC向造血分化进程涉及的转录调节因子主要为HOX家族相关基因，如Hoxb4、H o x a 9等。Helgason等【10 首先研究体外过表达Hoxb4基因可提高小鼠PSC向造血干细胞分化的能力。诸多研究进一步证实Hoxb4可促进PSC向HSC造血分化的能力，并形成了具备持续造血重建功能的HSC（l o n g-t e r m r e c o n s t i t u t i o n H SCs,LT R-H SCs)。Hoxb4虽可调节人PSC向HSC分化能力，但没有形成LTR-HSCs,并且人胚胎干细胞株不同,Hoxb4的造血分化调节功能也不同 。Hoxb4调控小鼠PSC向HSC分化在于调节造血，通过活化Hoxb4,开启HSC相关基因的扩增、重编程,以及与微环境相关基因的信号传递 10 。此外，Izawa 等 12 也证明,Hoxb4在PSC向HSC早期分化的进程中，促进形成轴旁中胚层，进而形成内源性PSC造血，说明Hoxb4通过生成分泌有关蛋白FRZB和造血生长因子来介导旁分泌效应，从而促进了PSC向HSC分化。Hoxb4调控小鼠PSC体外诱导分化成偏向于髓系分化的造血干细胞 13,另外,Hoxb4以病毒整合后存在致瘤问题，于是，科研人员便利用腺病毒进行包装Hoxb4,有效避免致瘤问题，瞬时过表达Hoxb4可使小鼠PSC分化成HSC，但鲜有报道分化的HSC是否具备长期造血能力 4Cdx4作为刺激Hox基因的上游造血转录因子，可提高PSC向HSC分化，Lengerke等【15 表明过表达Cdx4可提高PSC特异性地向造血中胚层分化，从而增加HSC的生成。在低致死剂量的小鼠模型中，过表达Cdx4和Hoxb4均可提高PSC向HSC的多向分化，证实了Cdx-Hox在血液细胞发育途径中，可增加PSC向血液下游细胞分化。Hoxa9作为造血和白血病细胞生成的重要转录因子,Ramos-Mejia等 16 认为Hoxa9由人胚胎干细胞向造血分化，主要表达造血前体细胞（CD31*CD34*CD45*细胞），但向全部CD45*血细胞分化进504中42卷生医国报程学学物程中，造血前体细胞表达显著下降。该研究显示Hoxa9在全部CD45*血细胞中提高造血前体细胞数量，继而提高人胚胎干细胞向HSC分化的能力，同时该研究发现Hoxa9介导的上调基因富集NF-kB信号通路，提示Hoxa9可能是通过激活NF-kB信号通路进而促进人胚胎干细胞造血分化。Runxl在胚胎生长发育过程中作为构建机体造血系统的调控转录因子，导致多数染色体易位从而引起人白血病。科研结果显示，小鼠胚胎生长发育过程中,Runxl在血液细胞形成的所有部位都有表达，在所有能产生成体HSC的部位都表达，但Runx1-/-的ESC丧失了造血分化能力，表明胚胎发育中,成体HSC 可参与定向造血调控 17 。Runx1可促进内皮细胞向HSC分化【18 ，下调胎肝中胎肝激酶-1（Flk-1）的表达 19。Ran等 2 0 发现,过表达Runxl的亚型基因Runxla,可增强人ESC和iPS细胞中的CD34*CD45*造血干/祖细胞的生成。研究还指出，在NSG小鼠中通过慢病毒过表达Runxla，使PSC生成HSPCs,且向下游髓系和淋系（B细胞）细胞分化。据报道,Lhx2、SCL、SO X 17 以及有关调控转录因子MiR-24和Bmil等在PSC向HSC分化进程中同样起关键的调控作用。Kitajima等 2 1 研究证实，过表达Lhx2可促使小鼠PSC向HSC分化。在人ESC的造血分化进程中，内源性转录因子SCL低表达CD45*血细胞，高表达分化源的CD45CD31*CD34*细胞。而过表达SCL，虽可加快形成人ESCs源的造血内皮祖细胞，进而分化并产生原始CD34*CD45*细胞和克隆能力强的CD45*血细胞，但需要其他调节机制才能产生人体造血重建潜力的HSC。敲降内源性SCL可抑制人ESCs造血细胞的定向分化，从而证实了SCL促进人ESCs的早期造血功能 2-2 3。据报道，过表达SOX17转录基因，可促进人PSC来源的HE细胞增殖及扩增，其中SOX17在CD34*CD43*的微血管内皮细胞中高表达，在CD34*CD43*CD45(pre-hematopoietic progenitor cells,pre-HPCs）和CD34*CD43*CD45*HPCs细胞中低表达，SOX17失活仍具备造血潜力以及产生造血细胞。而SOX17过表达后呈半贴壁细胞簇且生成部分造血细胞，且CD34*CD43CD45/low细胞为原HE细胞，介于内皮细胞和pre-HPCs之间 2 4。同时，过表达SOX17可使人pre-HPCs和HPCs重新编程为原HE细胞，对SOX17及结合位点的全基因组图谱分析表明，SOX17为活化血管、调节造血功能及红细胞分化等调节人PSC造血分化机制的关键转录基因 2 5Wang等 2 6 研究表明，LGR4在人PSC的造血分化进程中，通过TGF-Beta信号通路促使其向中胚层诱导分化，可提高人PSC造血分化潜力。Tashiro等 2 7 曾报道，由于Lnk通过负向调节TPO和SCF信号通路，干扰了HSC扩增及自我更新，抑制了转录因子Lnk的活性，从而增加了PSC源的造血细胞的生成。Lis等 2 8 还发现，利用Fosb、G f i 1、R u n x 1和Spil四个转录因子能成功实现小鼠内皮细胞到功能性HSC的转化，获得的HSC在体内具有长期造血重建的潜力。同时HSC来源的T细胞也具备了抗原依赖的适应性免疫能力。另外,Fidanza 等 2 9利用ERG、H O X A 5、H O X A 9、H O X A 10、LCO R、RUNX1和SPI1转录因子将人PSC来源的HE细胞从NSG小鼠体内向HSC细胞中的转移，从而获得了一次二次移植的HSC,但转录因子介导的PSC来源的HSC向临床转化仍存在诸多问题待解决，其诱导分化体系的稳定性、可重复性以及安全性问题仍有待解决。由此可见，Lhx2、H O X B4、H O X A 9、R U NX 1、CDX4、G f i l/Fo s b/G f i 1/R u n x 1/Sp i l、ER G/H O X A 5/HOXA9/HOX10/LCOR/RUNX1/SPI1等转录因子从内源性调控到体外PSC造血细胞分化进程中起着主要作用，体外过表达这些造血转录因子可促进PSC造血分化。2.1.2信号通路调控PSC向造血干/祖细胞分化在小鼠模型中,Notch1对成血管细胞分化为造血细胞的关键在于调控正常原始造血祖细胞的生长与分化 30 。Dietrich等 31 研究发现，瞬时调节Notch信号通路会增加ESCs生成造血细胞。Jang等 32 研究发现，激活Notch信号通路可提高小鼠ESCs造血潜力，同时会促进HE细胞的定向造血分化。Russo等 33 研究发现，活化的Wnt和nodal信号通路在人ESCs分化进程中，利于形成原条样细胞。Wu等 34 首先报道在人ESCs造血分化进程中，加入Wnt信号通路抑制因子DKK1可以明显降低造血分化能力，经过与表达Wntl基因饲养层共培养，从而激发经典的Wnt信号通路，显著提高造血分化能力并形成更高比例的CD34brightCD31*Flk1*细胞。Vijayaragavan等 35 报道，非经典的Wnt信号通路可重塑人ESCs的早期造血命运调控。另外还发现，利用Wnt3a激活典型的Wnt信号通路，505李艳伟，等：多能干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展4期可促使人ESCs来源的造血前体细胞的扩增。相反，Wnt11激活非经典的Wnt信号通路调节人ESCs定向中胚层分化。在定向EB的形成过程中，Wnt11可诱导人ESCs表达中胚层基因T。敲除Fzd7抑制人ESCs 的定向中胚层分化。另外,Sturgeon 等 36 还发现，Wnt信号通路能定向地调节人PSC向成体原始造血分化，在人ESCs向造血细胞分化时，通过活化activin-nodal通路、控制Wnt-catenin信号通路、促进人原始造血分化，进而产生原始的KDR*CD235a*造血祖细胞。而出现的成体KDR*CD235a造血前体细胞则需要通过Wnt-catenin信号通路启动，表明通过PSC定向分化为成体造血祖细胞必须选择性启动Wnt-catenin信号通路。Wang等 37 还发现，Wnt和BMP4信号通路促进了人成纤维细胞起源的iPS细胞定向血液细胞分化。Wang等 38 的研究发现，人ESCs造血机制分化是通过抑制TCF-信号通路，从而增加了人ES细胞来源的HE细胞定向造血祖细胞的分化效率，然而借助TCF-抑制剂如SB431542可明显提高人HE向CD34*的造血机能祖细胞分化。Bai等 39 的研究表明,在人PSC的造血分化进程中，由于TGF-蛋白表达增多,使其在人PSC造血和内皮分化的阶段形成了双刃效应。其中，在向中胚层分化时，激发了TCF-信号通路促使中胚层分化，形成CD34*CD31*血管内皮细胞，因而增多了SB431542，阻滞TCF-信号通路下调了中胚层相关分子的表达，减少了CD34*CD31*毛细血管内皮祖细胞的形成。但在中胚层分化后，通过抑制TGF-信号通路，从而促进CD34*CD31*血管内皮祖细胞的生成，表明在诱导分化进程中，选择合适的位点对TGF-信号通路的正向和负向作用都是必要的，已成为改善PSC造血功能形成和血管生成的有效方法。Saxena等 40 的研究表明，cAMP信号通路也具备介导生血形成和增加功能造血细胞的生成。在研究人PSC造血机能分化模型时，激活cAMP信号可明显增加HSC样细胞的形成，这是造血细胞生成所必需的，通过阻滞cAMP信号通路减少HE细胞的产生，最终减少造血细胞的产生。进一步表明，在这群造血干/祖细胞中，,cAMP信号通路可以降低氧化损伤，从而形成了一种氧化还原反应的平衡状态，借助P表达，进而维持原始的功能造血细胞。该发现将拓展对造血发育过程的机制研究，同时也为临床诊治所必需具备移植潜力的人造血细胞提供了理论基础。以上表明，信号通路如Wnt/Notch/BMP4等介导的微环境在PSC造血分化调控中起重要作用（见图1）。在小鼠和无脊椎动物体内，Notch信号通路对造血细胞和内皮细胞的产生起着主要调节功能，而阻断Notch信号通路则抑制了胚胎血管和造血的发生。2.2外源微环境调控PSC向造血干/祖细胞分亻2.2.1基质细胞共培养诱导PSC向造血分化Kaufman等 41 首次使用了来源于小鼠骨髓的细胞系S17、来源于卵黄素的人脑微血管内皮细胞系C166分别与人类PSC共同培养，通过对共培养后的造血分化水平分析显示,PSC来源的造血前体细胞表达CD34表面分子和造血功能转录因子TAL-1、LM 0 2 和GATA2,而当半固体培养基中含有造血生长因子时，造血前体细胞就会克隆髓系、红系等，而表面标记血型糖蛋白A、CD 15及CD41则在造血中下游细胞内表达。可见该细胞分化体系提供了人造血分化思路，为输血与免疫治疗提供细胞来源。Demirci等 42 用OP9基质细胞研究人的PSC造血分化,结果表明,与OP9基质细胞联合培养8 9d后，就可得到约2 0%的人造血细胞，其中CD34*细胞纯度高达95%。而CD34*细胞中，造血相关的转录因子SCL/TAL1、G A T A-1、G A T A-2、FIk 1表达，在含有FIT3-L、SCF、I L7 时，与基质细胞MS5联合培养，CD34*细胞进而分化形成了髓系（粒细胞和巨噬细胞）和淋系（NK细胞和B淋巴），由此可见OP9与hPSC联合培养所产生的CD34*细胞，具有与成体HSC相似的生物特征。Qiu等 43 指出，人胎肝来源的细胞系FH-B-hTERT比S17更加有效地诱导hPSC向造血细胞的分化。Ledran等 44 的研究表明,早期造血祖细胞通过小鼠AGM或胎肝源的单层细胞及相应组织源的间质细胞系共培养，进一步促进hESC的造血分化而产生，并在第18 2 1d达到最高比例的CD34*细胞。在免疫缺陷小鼠模型体内,hESC源的造血细胞拥有更高的一次和二次造血重建潜力，嵌合率高达16%。Gordon-Keylock 等 45指出,与OP9细胞或者与AGM区的基质细胞联合培养，或者过表达Hoxb4途径等来研究诱导ES细胞的造血分化能力表明，AGM区的基质细胞比OP9更可推动ES细胞早期造血分化进程，并且AGM区基质细胞还可有效地促进中胚层细胞分化为造血祖细胞，而OP9并无该功能。Shan等46 通过研究发现，在OP9与hESC共培养过程中,hESC源的造血前体和造血机体祖细胞表达增强，由此认为OP9506中生医42卷国报程物学学诱导多能干细胞CAMP信号通路中胚层向中胚层分花后分化时增加CXCR4TGFB增加SB431542增加HSC样细信号通路胞成体KDR+CD235a-促进TGF抑制TGF造血前体细胞Wnt/BMP4信号通路信号通路信号通路Wnt_B-catenin信抑制TGF形成减少号通路信号通路CD34+CD31+CD34+CD31+血液细胞分化血管内皮细胞血管内皮细胞4-抑制造血分化一4原始激活WntCD34+造血机KDR+CD235a+信号通路能祖细胞造血祖细胞抑制Wnt1-信号通路与WWn基因饲养房11刺激造血细胞1nodali通路层共培养TGF内皮细胞政activin-信号通路WntNotch信号通路信号通路造血干细胞图1不同信号转导途径调节网络Fig.1Regulation network diagram of different signal transmission pathways细胞株可抑制造血前体细胞的调亡，促进了造血前体细胞生长。为此学者们还同时研发了联合转录因子和基质细胞,来增强PSC的造血分化。Chen等 47 研究，发现无论体内、体外，LHX2修饰后的OP9基质细胞均可促进PSC形成造血祖细胞。Yang等 48 研究转录因子EPO过表达后，人胎肝基质细胞可刺激hESC造血分化，其上清则可诱导hESC转化成为血液细胞，尤其分化形成了红细胞。Gori等 49 研究发现，血管内皮细胞促进了人PSC和多潜能的造血祖细胞分化，并使hPSC及表达JAG1和DLL4的大脑微血管内皮细胞共培养,形成了大量CD34*CD45*的造血功能祖细胞。脑微血管内皮细胞可活化PSC中的Notch信号通路以及造血靶基因RUNX1和GATA2。在NSG动物模型中，由脑微血管内皮细胞诱导的PSC来源的造血干/祖细胞和细胞因子诱导获得的造血细胞相比，拥有更高的植人效能；与单层分化体系诱导hPSC来源的造血细胞相比，植人效率高达2 0 倍，且倾向于分化髓系和淋系 50 可见基质细胞大都存在异质性，可以增强造血细胞分化效率，如S17/C166与PSC共培养或OP9基质细胞联合转录因子与PSC共培养为PSC的造血分化起到一定的调控作用，为后续研究提供了实验依据。2.2.2细胞因子调控PSC向造血分化Chadwick等 51 发现hESCs可分化成3个胚层的拟胚体（embryonic body，EB），通过细胞因子与BMP4（一种中胚层诱导因子）联合处理EB，从而明显增强其造血分化功能，这也证明了BMP4具备提高hESCs造血分化的能力，加人BMP4可改善诱导分化的效果。Pearson等 52 采用含微量造血生长因子的无血清培养基调节造血分化的每一个过程，可形成高纯度的造血祖细胞。表明activinA、BM P4、bFGF与VEGF的有序结合，能够有效促进小鼠ES的造血分化,并逐步特异性调节PSC造血分化。其中，BMP4有效促进并形成中胚层，activinA和bFGF可促使中胚层细胞定向成血管细胞的分化，VEGF则促进生成成熟的下游造血祖细胞，最后，bFGF和VEGF启动中胚层前体细胞并激活造血分化的过程。Nasrallah等 53 发现，内皮糖蛋白因子在内皮及造血干细胞表面TCF-受体表达的配体分子,经过一氧化氮合酶来促进成体造血，并对造血前体细胞的生长发育十分必要。Yu等 54 的研究表明，APELIN作为G蛋白偶联受体的配体肽段，可提高507李艳伟，等干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展4期hESCs的造血功能，还发现如果在培养基中加人APELIN肽段，可促进EBs的生长，促进hESCs的造血分化进程中有关基因表达，从而提高10 倍的成体血管细胞集落的形成能力，并且APELIN肽段还可以与VECF组合，促使hESCs源的血管内皮细胞生成。这些研究表明，APELIN可作为细胞因子促进hESCs的造血分化。Cerdan等 55 报道，通过上调了T基因的表达，activinA细胞因子刺激hESCs调控中胚层的生长发育。而体外PSC的造血分化分为多个阶段：首先是来源于原条并形成中胚层细胞，接着形成造血前体细胞，进而定向分化成内皮细胞和造血下游血液细胞系。另外，很多生长因子如activins与FGFs已被证实具备调节早期成体造血的功能,但是并不清楚这些细胞因子在hESCs的中胚层细胞和成体造血分化进程中起到什么作用。为了摸清细胞分子机制，再结合上述可刺激中胚层因子生长发育的因子，则有效提高hESCs的造血分化能力。研究还发现，activinA通过上调T基因的表达水平来促进中胚层分化及扩增造血机制等相关能力。Gertow等 56 报道，Wnt3A具备时序调节hESCs造血分化的潜力，经典的Wnt信号通路则有助于控制hESCs向中胚层和造血的分化,与没有确定成分的诱导分化相比，Wnt3A难以单独诱使中胚层分化，但Wnt3A与BMP4联合作用，则有助于加快中胚层形成,增大EB尺寸，增加形成造血集落的数量。Hirota等 57 报道，activinA和OP9基质细胞联合有助于激活mESCs形成Flk-1*PDGFR和Flk-1*PDGFR*造血中胚层。Pearson等 58 报道,无血清培养基与细胞因子（activin、BM P4、VECF、FGF)结合，可顺序调节小鼠ESCs生成具有体内造血再生作用的造血细胞。Wang等 59 的研究发现，在人PSC造血分化过程中,加人外源性的R-脊椎蛋白2(R-spondin2）因子，可启动下游的TCF-信号通路，从而促使人PSC的分化并生成APLNR*中胚层细胞，进而增强人PSC体外造血分化的潜力。Atkins等 6 0 的研究利用activinA、BM P4和FGF2诱导人PSC产生一群KDR*CD235a/b*中胚层细胞，该群细胞的体外诱导分化具有类似于小鼠体内卵黄囊早期造血发育的特征，可进一步诱导分化为红系、髓系以及/T细胞中的v82*亚细胞群的人类造血胚胎发育早期的细胞类型，同时该研究也表明人胚胎发育的红系-髓系祖细胞和淋系细胞可能来源于一群共同祖细胞 6 0 以上研究表明，BMP4、a c t i v i n A、b FG F、V EG F等细胞因子对于造血发育来说十分关键，在造血微环境过程中，由基质细胞调节胚胎造血发育主要是通过各类细胞因子来调节造血。同时在体外，通过细胞因子来控制PSC的造血分化也很重要，与不同造血功能有关的细胞因子相结合有助于促使PSC向造血干祖细胞的分化。2.3生物材料调节PSC定向造血分化研究PSC具有体外分化成三胚层任何细胞以及经移植免疫缺陷鼠产生畸胎瘤，可能因造血分化的作用。Oguro等 6 1 经过研究表明，在产生的畸胎瘤中，检测出CD45*CD34*的造血祖细胞及下游的髓系和淋系细胞，包括淋巴细胞、中性粒细胞、巨核细胞等。首次表明，通过畸胎瘤技术，将人PSC源的造血功能干祖细胞移植进人NSG或NOD-SCID免疫缺陷的小鼠体内，从而重构人的免疫功能系统，形成功能性的T淋巴细胞及B淋巴细胞。表明了畸胎瘤产生的微环境提供PSC向成体造血细胞分化的能力,对形成相似于人体HSC 的多能造血祖细胞研究提供了一个全新的指导。现阶段生物材料广泛用于PSC定向造血分化功能的研究，Zhang等 6 2 的研究指出，纤维蛋白支架所形成的3D结构显著促进了hiPSCs定向内皮细胞进行分化，其中约45%的分化细胞表达内皮细胞表型，且hiPSCs源的ECs可体外维持达4周的内皮细胞的状态。Xu等 6 3 报道3D微载体可维持hESCs功能性并产生拟胚体，而经过3D产生的EB重新接种到平板后，极易分化成具备定向造血及向内皮细胞定向分化能力的成血管细胞，且3D体系还可被用于诱发hESCs分化成成血管细胞，运用该无血清无鼠源性的基质细胞微载体系统，将为临床开展GMP大规模细胞治疗应用平台奠定基础。另外,该团队目前借助3D自组装多肽生物材料，有效诱导小鼠和人的多能干细胞，继而产生了一群具有短期造血重建潜力的造血祖细胞,为PSC源的HSC从基础研究向临床转化研究奠定基础(6 4-6 5。这些研究表明，生物材料介导的三维环境更好地模拟了体内造血发育的分化模型，为PSC向HSC造血分化研究提供了新平台。但目前生物材料介导PSC向造血分化的具体调控机制有待于进一步探究，有文献报道三维水凝胶材料是通过激活内在Wnt信号通路来增强PSC向中胚层分化 6 6 ,但目前三维生物材料介导PSC向造血分化的机制有待于深人探究。508中42卷生医报程学学国物3PSC 向 HSC/HSPC功能移植应用存在的问题目前HSC移植仍面临所需移植造血细胞数量不足的难题,而PSC来源的功能性HSC/HSPC的移植能从根本上解决HSC移植面临的瓶颈问题。同时,从临床角度考虑,PSC来源的功能性HSC/HSPC的移植解决免疫排斥、供着数量匮乏问题同时，还能降低自体或异体HSC移植所需的大量经济成本问题。但PSC向HSC/HSPC功能移植应用仍面临问题待解决。首先，关于PSC源的HSCs造血植人潜力：目前，尽管体外可以利用不同方式诱导PSC分化并生成更多的造血样细胞，但还没有产生真正意义上体内具备长期造血的潜力HSC，鲜有文章报道造血植人，且植人效率低下，而人ESCs来源造血功能细胞的造血重建效果很有限。在绝大多数的异基因造血干细胞的移植实验中，人PSC来源的造血细胞移植检测结果表明，人CD45*细胞中几乎没有，且短期内也仅仅只有小于1%的植入效率 。少数研究指出,来源于ESC的CD34*细胞在经过二次移植后，人CD45*植入率大于1%，但该研究仍无法重建功能性B淋巴细胞和T淋巴细胞,因此表明重建造血细胞并定向下游各谱系的分化能力非常有限 6 7 ,尽管过表达转录因子LHX2或HOXB4可提供来源于小鼠ESCs 的造血样细胞的造血重建功能，但该转录因子过表达后，并没有生成具备体内造血植人潜力的造血样细胞1.2 1。安全性方面：1)来源于PSC 的HSC 临床应用,需达到临床的一系列安全标准。细胞用于移植，需注意增殖细胞群移植到体内后，能否建立一套完整的体内稳态，从而来挽救病人的生命。2)对于来源于iPS的HSC移植，首先考虑iPS的多能性相关基因是反转录病毒还是慢病毒介人，因为这些插人载体所包含的启动子、增强子、剪接体及插入的基因组都有使他们存在插人性突变的可能性。另外，关键性的重装基因关系到各种类型肿瘤的形成，例如MYC作为重要的肿瘤原癌基因,在各类白血病细胞中广泛表达。3)未分化的PSC移植与畸胎瘤形成的关系。来源于人PSC的HSCs需避免异源细胞如小鼠基质细胞等混在里面。鉴于人源种属的特异性，建议使用低于人的灵长类动物为医学研究对象 。4)归巢问题：评估来源于PSC的HSC的潜能时，会考虑移植方法的选择如尾静脉或骨髓腔移植，最终仍要依据HSC是否具备归巢到骨髓，并定向移植人包含造血生长因子的微环境中，可见对于来源PSC的HSCs的归巢能力评估是其临床转化的关键。需多个步骤帮助HSCs完成归巢,且每个步骤分别执行对应的分子调控。目前来源于PSC的造血干祖细胞仍缺失造血植人能力，表明来源于PSC的HSCs的归巢存在问题，导致来源于PSC的HSCs功能仍不完整。4PSC定向HSC/HSPC分化研究展望现阶段，未经基因修饰仍很难诱导PSC体外获得真正意义上的HSC。尽管有报道指出，仅仅利用MLL-AF4一个条件转录因子足以诱导PSC产生具有造血植人潜能的HSC，但是获得HSC由于MLL-AF4介导HOX的异常表达从而导致急性髓系和淋系白血病的发生 6 9。因此为了产生能用于临床的PSC来源的HSC,从安全性角度考虑，应从小型和大型模式动物切人评估PSC来源的HSC的安全性，同时PSC来源的HSC存在未分化的PSC会引起畸胎瘤的发生，这也是PSC来源HSC应用面临的关键难题 2 。为此，可通过提高分选和筛选策略来到去除未分化的PSC。有研究报道，利用两个小分子条件性诱导可以清除残留的未分化的PSC,阻止畸胎瘤形成，对未来PSC来源的细胞应用于临床提供安全保障，但同时仍需考虑小分子所带来的不良反应 7 0 PSC作为产生HSC的细胞来源,对于治疗血液疾病的意义重大,特别是iPS细胞为临床研究提供丰富的可供移植的HSC,有望解决临床HSC移植应用方面的很多问题 7 1。另外，从范科尼贫血、慢性髓细胞性白血病、镰状细胞贫血等患者中来源的iPS细胞中获得的HSCs对疾病治疗研究至关重要 7 2-7 3。针对PSC 体外造血诱导分化的方法作详细的概述与总结（见图2），解决PSC向HSC分化过程中的问题，如1）鉴定体内对HSC发育最重要的转录因子；2)在胚胎发育过程中，弄清楚特异性调控HE细胞和HSCs的分子调控机制和微环境因子；3)体外筛选并扩增PSC源的HSC的小分子化合物库；4)建立造血微环境来近似模拟体内造血发育途径，调控造血分化的关键信号通路；5)解决PSC源的HSC安全及归巢等问题，最终从PSC得到可供长期移植的HSC。可见，体外建立稳定、高效PSC定向HSC诱导分化的体系，可使来源于PSC的HSC被广泛应用于临床研究及治疗成为现实。随着血液恶性肿瘤发生率的增加，目前嵌合抗509李艳伟，等等：多能干细胞向造血细胞定向诱导分化的研究进展4期内在调控机制成纤维细胞HOXB4LHX2HOXA9RUNX1CDX4Gfi1/Fosb/RUNX1/SpilERG/HOXA5/HOXA9/HOX10/LCOR/RUNX1/SPI1造血干细胞诱导多能干细胞S17或C166基质细胞培养OP9联合转录因子Wnt/Notch/BMP4p