多玛绵羊繁殖季节与非繁殖季节生殖激素水平及其受体表达水平分析.pdf

中国草食动物科学2023 年多玛绵羊繁殖季节与非繁殖季节生殖激素水平及其受体表达水平分析何冰梅1，金美多吉2，王品珍2，3，龙桑4，强晓明2，尼玛曲桑5，其米6，宋天增1（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850004；2.西藏安多县农牧业科学技术服务站，安多 853400；3.辽宁省沈阳市辽中区农业技术推广与行政执法中心，沈阳 110200；4.西藏安多县措玛乡综合文化服务中心，安多 853499；5.西藏安多县扎曲乡文化综合服务用心，安多 853417；6.西藏安多县措玛乡农牧综合服务中心，安多 853499）摘要：为研究多玛绵羊生殖激素浓度和下丘脑-垂体-卵巢轴上生殖激素受体表达水平在发情季节与非发情季节的差异情况袁 使用 ELISA 测定了 60 只多玛绵羊发情与非发情季节血清中促性腺激素释放激素 渊GnRH冤尧 促卵泡素渊FSH冤尧促黄体素渊LH冤和促甲状腺激素渊TSH冤的浓度袁下丘脑-垂体上促性腺激素释放激素受体渊GnRHR冤袁卵巢上促卵泡素受体渊FSHR冤和促黄体生成素受体渊LHR冤袁以及子宫内膜上孕激素受体渊PGR冤和雌激素受体渊ER冤的表达水平遥 结果显示,多玛绵羊血清中 GnRH尧FSH尧LH 在非发情季节显著低于发情季节渊P0.05冤袁下丘脑 Kisspeptin 与KISS1R 在发情季节显著增加渊P0.05冤曰下丘脑-垂体组织中 GnRHR 基因袁卵巢上 FSHR 和 LHR 基因以及子宫内膜中 ER 和 PGR 基因的表达水平在发情季节显著高于非发情季节渊P0.05冤遥发情季节卵巢切片上发育卵泡的数量显著多于非发情季节渊P0.05冤曰发情季节 FSHR尧LHR 阳性细胞密度显著高于非发情季节渊P0.05冤曰发情季节 ER和 PGR 阳性腺上皮细胞显著高于非发情季节渊P0.05冤袁但子宫 PGR 阳性基质细胞在发情季节和非发情季节之间没有显著性差异渊P0.05冤遥 由此可见袁多玛绵羊下丘脑-垂体-卵巢/子宫中主要生殖激素及其受体的表达水平在发情季节高于非发情季节遥关键词：多玛绵羊;发情季节曰非发情季节曰生殖激素曰下丘脑-垂体-卵巢轴中图分类号：S826.3文献标志码：A文章编号：2095-3887（2023）05-0036-06收稿日期：2023-06-15基金项目：西藏自治区自然科学基金（XZ202101ZR0070G）；西藏自治区中央引导地方项目（XZ202101YD0019C）；那曲市重点研发项目“西藏安多县多玛绵羊良种扩繁与短期育肥技术研究”作者简介：何冰梅（1971-），女，副研究员，研究方向为高原动物疫病防控通信作者：宋天增（1980-），男，副研究员，研究方向为羊的遗传与繁殖营养调控HE Bingmei1，JINMEI Duoji2，WANG Pinzhen2，3，LONG Sang4，QIANG Xiaoming2，NIMA Qusang5，QI Mi6，SONG Tianzeng1（1.Institute of Animal Science，Tibet Academy of Agricultural&Animal Husbandry Science，Lhasa 850004，China；2.Service Station ofAgriculture and Husbandry Science and Technology of Ando County，Anduo 853400，China；3.Agricultural Technology Extension andAdministrative Law Enforcement Center，Liaozhong District，Shenyang City，Liaoning Province，Shenyang 110200，China；4.CulturalServiceCenter of Cuoma Township，Anduo 853499，China；5.CulturalService Center of Zhaqu Township，Anduo 853417，China；6.Service Center ofAgriculture and Husbandry of Cuoma Township，Anduo 853499，China）The purpose of the experiment was to study the difference of reproductive hormone concentration and the expression ofrepraductive hormone receptor on the hypothalamus pituitary ovary axis between estrous and non estrous seasons in Dormasheep.ELISA was used to determine the concentrations of gonadotropin-releasing hormone（GnRH），follicle stimulatingdoi：10.3969/j.issn.2095-3887.2023.05.00636第 43 卷第 5 期hormone（FSH），luteinizing hormone（LH）and thyroid-stimulating hormone（TSH）in the serum of 60 Dorma sheep in estrousseasons and non estrous seasons,as well as the gonadotropin-releasing hormone receptor（GnRHR）on the hypothalamus pitui-tary，follicle stimulating hormone receptor（FSHR）and luteinizing hormone receptor（LHR）on the ovary，and the expression levelof progestogen receptor（PGR）and estrogen receptor（ER）in endometrium.The results showed that the GnRH，FSH，and LH le-vels of the serum in Doma sheep were significantly lower non estrous seasons than estrous seasons（P0.05），while the levels ofKisspeptin and KISS1R in the hypothalamus were significantly increased during estrous seasons（P0.05）；the expression levelsof GnRHR gene in the hypothalamic pituitary tissue，FSHR and LHR gene in the ovaries，and ER and PGR gene in theendometrium were significantly higher during estrous season than non estrous season（P0.05）.The number of developingfollicles on ovarian slices during estrousseason wassignificantly higher than that during non estrousseason（P0.05）；the densityof FSHR and LHR positive cells in estrus season was significantly higher than that in non estrus season（P0.05）；during theestrous season，ER and PGR positive glandular epithelial cells were significantly higher than those during the non estrous season（P0.05），but there was no significant difference in uterine PGR positive stromal cells between the estrous and non estrousseasons（P0.05）.In summary，the expression levels of the main reproductive hormones and their receptors in the hypothalamuspituitary ovary/uterus of Doma sheep were higher during estrous season than non estrous season.Dorma sheep；estrus season；non-estrus season；reproductive hormone；hypothalamus-pituitary-ovary axis多玛绵羊主要分布在西藏唐古拉山南北两侧的多玛县及其周边地区，其体格大，体质结实，身体结构匀称咱1暂，而且产毛多，毛质优良咱2暂。多玛绵羊肉质细嫩、膻味低，目前已成为国家“地理标志”产品咱3暂。多玛绵羊常年生活在高海拔、低温、饲草资源贫乏的高寒地带，具有很强的抗逆性，而且形成了季节性发情的特点，每年主要在秋季发情咱2暂。哺乳动物的季节性繁殖需要神经系统和内分泌系统的协同调节。自然环境日照长短的变化形成的季节交替以光-温形式作用于松果腺，引起褪黑素（MLT）分泌的改变咱4-5暂，进而周期性地影响下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）分泌水平的改变，通过哺乳动物的下丘脑-垂体-卵巢调节系统（HPOA），进一步影响促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）以及雌激素（E2）和孕酮（P）的分泌咱6-7暂。此外，在 GnRH 的上游，有调节雌性生殖功能的重要神经肽 Kisspeptin，其通过 KISSR 基因编码受体在下丘脑的表达，影响下丘脑在繁殖过程中的核心调节作用咱8暂，从而影响 HPOA 的相关功能。季节性繁殖的绵羊为适应外界自然环境的周期性变化进化出与其相适应的季节性发情现象。对于绵羊季节性发情的研究，目前主要集中在两个方面：譹訛不同季节主要生殖激素 E2、P、FSH、LH 的变化咱9-11暂，以及 MLT、LH、FSH 激素对发情季节的调控咱11-12暂；譺訛各种基因多态性与季节性发情的相关性咱13暂，以及不同发情与非发情阶段下丘脑-垂体-卵巢轴中基因的表达水平咱12暂。随着人工养殖水平的提高，提高非发情季节母羊的繁殖性能意义重大。目前对多玛绵羊发情季节与非发情季节的生殖内分泌的相关研究仍然缺乏。因此，本研究旨在通过对多玛绵羊血清中 GnRH、FSH、LH 和 TSH 浓度的测定，以及 下 丘 脑 垂 体 中 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 受 体 基 因（GnRHR），卵巢上促卵泡素受体基因（FSHR）和促黄体素受体基因（LHR），子宫内膜上孕激素受体基因（PGR）和雌激素受体基因（ER）表达水平的检测，揭示多玛绵羊发情季节与非发情季节主要生殖内分泌的差异。1 材料与方法1.1 试验动物随机选择 23 岁、体重相近、健康空怀的多玛母绵羊 66 只，以放牧为主，自由采食和饮水。其中 60 只用于血清收集，6 只用于屠宰试验。在实验过程中，对试验羊的处理严格遵守中国实验动物相关福利规定。1.2 血清与组织样本收集在发情季节（2021 年 10 月）和非发情季节（2021 年3 月），每只羊每间隔 3 d 早、晚分别采集血清 1 次，连续采集 7 次，每个个体的血清作为混合样用于激素测定；在发情季节和非发情季节分别屠宰 3 只母绵羊，收集下丘脑-垂体、卵巢和子宫，用于基因表达水平检测和激素受体的免疫组化分析。1.3 激素水平检测用 ELISA 试剂盒检测血清中的 GnRH、FSH、LH 和TSH 浓度。GnRH（DRE-S0528）、FSH（DRE-S9373）、LH（DRE-S9371）和 TSH（DRE-S9310）的 ELISA 试剂盒来自 R&D system 进口分装。试剂盒从 4取出后在室温平衡 20 min。设置好标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度的标准品 50 滋L，样本孔加待测血清样本 50 滋L，用封板膜封板后置 37温育 30 min 后重复 5 次洗板，然后研究论文37中国草食动物科学2023 年每孔加入 HRP标记的检测抗体 50滋L，在 37温育 30 min后重复 5 次洗板，最后加入底物 A、B 各 50 滋L，37避光孵育 15 min 后加入终止液 50 滋L，在 15 min 内用 Va-rioskanTM连接波长光阅读器（Thermo，USA）在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值。用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度。1.4 RNA 提取与 cDNA 合成取 100 mg 组织样品在液氮中匀浆后移入含有 1 mL的 Trizol 试剂，用枪头吹打混匀。向离心管中加入 0.2 mL氯仿后用手剧烈振荡 10 s，然后在冰上放置 23 min，于4、12 000 r/min 条件下离心 15 min，将上清液转移至另一无 RNA 酶的离心管中；加入 0.5 mL 的异丙醇，混匀后置于冰上孵育 10 min，于 4、12 000 r/min 条件下离心10 min，离心管底部可见 RNA 沉淀，弃上清；向沉淀中加入 1 mL 预冷的 75%乙醇（250 滋L DEPC 水和 750 滋L 无水乙醇混合，现配现用），漩涡混合仪上混匀，于 8000r/min、4条件下离心 5 min，弃上清；倾斜离心管，用枪头吸去管壁的液体。待 RNA 在空气中室温自然干燥后（510 min），加入适量的 DEPC 水溶解，用 NanoDrop 2000 检测 RNA 样品的浓度和纯度。检测合格的 RNA 根据反转录试剂盒 Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）合成 cDNA 第一链。按照 2 滋L 的 5gDNA Eraser Buffer、1 滋L 的 gDNAEraser、1 滋g 的总 RNA，加 Rnase-Free dH2O 到总体积10 滋L 配制反应体系，然后按照 42维持 2 min 进行基因组 DNA 去除，最后降温至 4备用。然后取上述步骤去除 gDNA 的反应液 10 滋L，加入 1 滋L 的 Primescript RTEnzyme Mix I，1 滋L 的 RT Primer Mix，4 滋L 的 5 Prime-Script Buffer 2 和 4 滋L 的无 RNA 酶的 H2O，构成 20 滋L的反转录体系。在 37下 15 min 进行反转录，在 85下5s 灭活反转录酶，最后降温至 4保存备用。1.5 qRT-PCR 反应利用 Primer Premier 5.0 软件设计 GnRH 受体基因GnRHR、KISS1R 基因以及内参 GAPDH 基因的引物（表1），所有引物由擎科生物公司合成。表 1 引物信息表基因GnRHRFSHRLHRERPGRKISS1RGAPDH引物序列（5-3）F：AGCAAGCTCGGACAGTTCATR：CAGTCTGTCCAGAGTCATCTGCF：GAGGAATGCCATTGAACTGAGGR：AAGGTTGGAGAACACATCTGF：CTGGAGAAGATGCACAATGGR：AATTAGCCTCTGAATGGACTCF：GCGTATGAGTTCAACGCCGR：GGCTCGGAGACACGCTGTTF：GCTGCCCCCGCTACCAAAGGR：TCCCCTGGGCAGCACCTTGTF：CAGCCCTTGTCCGCGTCR：CTTGTGGCGACAGATGACGAF：AGCCGTAACTTCTGTGCTGTR：TTCCCGTTCTCTGCCTTGAC产物大小/bp115150118154108210234登录号NM_001285612.1NM_001009289NM_001278566U30299U30300JQ812137XM_005680968.3采用 SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒进行 mRNA 的RT-qPCR 检测，10 滋L 反应体系中包含 5 滋L TB greenPremix，上下游引物各 0.5 滋L，1 滋L 的 cDNA 模板和 3 滋L的无 RNA 酶的 H2O。qRT-PCR 反应条件：95预变性30s，95变性 5s，65退火 30 s，72延伸 30 s，共 40 个循环。扩增完成后进行熔解曲线分析：95维持 10s，65处理 5s。此后从 65开始，每一个循环温度增加 0.5，时间为 5s，获得熔解曲线评估扩增产物的特异性。1.6 免疫组化分析将下丘脑-垂体、卵巢和子宫组织放入 10%的中性福尔马林浸泡 23 d，修块后置于包埋盒内，再浸泡在10%中性福尔马林 35 d。自来水冲洗 12 h 后依次在70%、80%、90%、95%、99%、100%的乙醇溶液、3 个二甲苯溶液和 3 个脱蜡溶液中进行脱水，石蜡包埋，4 滋m 厚度切片、展片，然后切片置于 45烘箱放置 48 h 以上；切片依次放入二甲苯（和）中各脱蜡 1 min，再依次放入不同浓度的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%）中30 s，脱水完毕后放到烧杯中由自来水缓慢冲洗 10 min完成水化，然后采用高温进行抗原活化，随后将切片浸泡于 3%H2O210 min 后用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min，再38第 43 卷第 5 期滴加正常山羊血清稀释液覆盖切片暗盒内室温孵化 30 min，甩干血清，在 4下孵育一抗（Anti-kisspeptien（abs120178，Absin）、Anti-FSHR（sc-13935，Santa Cruz）、Anti-LHR（sc-25828，Santa Cruz）、Anti-ER（sc-542，SantaCruz）和 Anti-PGR（sc-538，Santa Cruz），阴性对照用非特异性 IgG 代替一抗 14h；切片漂洗后滴加二抗（山羊抗兔）室温孵育 1 h，再次浸洗后标记辣根过氧化物酶的SABC，然后用 DAB 在显微镜下显色后用苏木精反染30 s，切片脱水后用树脂封片。1.7 数据分析发情季节与非发情季节的激素水平采用配对 t 检验；qRT-PCR 数据采用 2-ct方法计算 mRNA 的相对表达量，然后进行 t 检验；免疫组化切片分析 3 个独立视野，然后计算 105滋m2的阳性细胞数。采用 SPSS 20.0 软件对结果进行显著性分析。结果以平均值标准差表示。2 结果与分析2.1 血清中激素浓度比较由表 2 可知，在非发情季节，GnRH、LH 和 TSH 的浓度显著低于发情季节（P0.05），FSH 的浓度极显著低于发情季节（P0.01）。表明在非发情季节，下丘脑的GnRH 和垂体的促性腺激素（FSH、LH）在外周血液中的水平均低于发情季节。而且在发情季节与非发情季节，与母羊基础代谢相关的激素 TSH 水平也存在差异。2.2 KISS1R 基因表达水平图 1A 显示，发情季节 KISS1R 基因在下丘脑的表达量极显著高于非发情季节（P0.01）；免疫组化显示（图1B），Kisspeptin 阳性细胞（图 1B）在发情季节的密度（108.6105滋m217.3105滋m2）极显著高于非发情季节（65.3105滋m28.2105滋m2）（P0.01）。表明下丘脑Kisspeptin 与 KISS1R 的 增 加 可 能 与 发 情 季 节 调 节相关。2.3 激素受体基因表达水平比较GnRHR、FSHR、LHR、ER 和 PGR 基因的相对表达水平见图 2。可以看出：在下丘脑-垂体组织中，GnRHR 基因在发情季节的表达水平极显著高于非发情季节（P0.01）；在卵巢中，FSHR 和 LHR 基因的表达水平在发情季节均极显著高于非发情季节（P0.01）；在子宫内膜中，ER 和 PGR 基因的表达水平在发情季节均极显著高于非发情季节（P0.01）。表 2 非发情季节与发情季节激素浓度比较GnRH/（pg mL-1）非发情季节（n=60）发情季节（n=60）119.04依6.00150.97依7.09*LH/（mIU mL-1）11.37依1.2417.53依8.45*FSH/（mIU mL-1）62.60依6.12109.28依8.45*TSH/（mIU mL-1）10.29依1.3116.17依1.58*注：*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01）。下同A.KISS1R 基因在下丘脑的表达水平；B.Kisspeptin 免疫组化标记，寅阳性细胞，比例尺=50 滋m图 1 发情季节与非发情季节多玛绵羊下丘脑中 KISS1R 表达水平研究论文非发情季节发情季节BA181614121086420非发情季节发情季节项目39中国草食动物科学2023 年2.4 激素受体免疫组化分析对卵巢中 FSHR、LHR 和子宫内膜 ER、PGR 进行免疫组化检测（图 3）。结果表明，发情季节卵巢切片上发育卵泡的数量显著多于非发情季节（P0.05）；FSHR、LHR 阳性细胞主要分布在卵泡周围，在发情季节的阳性细胞的密度均显著高于非发情季节（P0.05）；ER 主要定位于子宫内膜上皮细胞，PGR 主要位于子宫内膜基质层和腺上皮细胞，发情季节 ER 阳性细胞和 PGR 阳性腺上皮细胞均显著高于非发情季节（P0.05），但子宫 PGR阳性基质细胞在发情季节和非发情季节之间没有显著差异（P0.05）。图 2 发情季节与非发情季节多玛绵羊下丘脑-垂体中 GnRHR、卵巢中 FSHR 和 LHR、子宫内膜中 ER 和 PGR 的表达水平注：G.颗粒细胞；pF.原始卵泡；sF.刺激卵泡；tF.三级卵泡；O.卵母细胞；uG.子宫腺；L.子宫腔；比例尺=50 滋m图 3 FSHR、LHR、ER 和 PGR 免疫组化检测6543210下丘脑-垂体复合体卵巢子宫内膜GnRHRFSHRLHRERPGR非发情季节发情季节FSHRLHRERPGR非发情季节发情季节非发情季节发情季节3 讨论本试验研究了多玛绵羊发情季节与非发情季节下丘脑中 KISS1R 和 Kisspeptin，以及下丘脑-垂体-卵巢/子宫中与发情相关激素和受体的表达差异，揭示了多玛绵羊在发情季节与非发情季节的调控机制。1996 年 Lee 等发现了 Kisspeptin，随后通过进一步研究发现 Kisspeptin 可通过 G 蛋白受体（KISSR）调控GnRH 的分泌，进而通过下丘脑-垂体-卵巢轴来调节雌性动物的繁殖过程咱12暂。已有的研究表明，在草地型藏羊和小尾寒羊的大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管中，Kisspeptin 在下丘脑的表达水平最高，且产羔数高的小尾寒羊的表达水平显著高于草原型藏羊咱13暂。对季节发情机制的研究表明，光照/黑暗周期的变化通过多巴胺影响 Kisspeptin 神经元释放 Kisspeptin，促进GnRH 分泌，进而诱导雌性动物发情咱14-15暂。在本研究中，发现在发情季节 Kisspeptin 和 KISSR 在多玛绵羊下丘脑中的表达水平显著增加，这与已有的研究结果一致咱15暂。对小尾寒羊和滩羊外周血液中 FSH 和 LH 在春、夏、秋、冬季节变化的测定结果表明，小尾寒羊外周血液中FSH 和 LH 在春、夏、秋、冬 4 个季节基本稳定；滩羊生殖激素变化具有显著的季节性，FSH 和 LH 的分泌量在秋冬季节高于春季和夏季咱9暂。张小辉咱16暂研究发现，小尾寒40第 43 卷第 5 期研究论文羊、同羊、滩羊血液中 LH、FSH 的水平以及 LH 的脉冲频率存在明显的季节性变化规律，在春分时较低，在夏至和秋分时明显升高。而在本研究中多玛绵羊以放牧为主，外周血液中 FSH 和 LH 在发情季节（10 月）显著高于非发情季节（3 月），其 FSH 和 LH 的季节性变化可能与滩羊类似。有关发情与非发情季节 TSH 分泌水平的研究尚未见报道，但有研究者证明，TSHR 基因的表达可能与绵羊季节性发情有关咱17暂，这间接反映了 TSH 水平可能与发情季节有关。本研究结果表明，多玛绵阳 FSHR、LHR、ER 和 PGR的表达水平在发情季节比非发情季节高，同时也发现发情季节 Kisspeptin 的增加，促进了 GnRH 水平的上调，在下丘脑-垂体-卵巢轴的驱动下，最终可能诱导 E2基础水平增加，而 E2可诱导子宫内膜上 ER咱18暂和 PGR咱19暂在子宫内膜表达。GnRHR 的表达受 GnRH、卵巢类固醇激素、激活素和抑制素的共同作用咱20暂，FSHR 在颗粒细胞中的分泌受雄激素、激活素和 GDF9 的调控，LHR 的表达受FSH 的诱导咱21暂，所以以类固醇激素为基础形成了促性腺激素和类固醇激素受体的调节网络。发情季节的出现可能是在 Kisspeptin 的起始驱动下，通过下丘脑-垂体-卵巢轴使卵巢分泌的类固醇激素和激活素增加，进一步使促性腺激素受体和类固醇受体表达增加，从而增强了卵巢和子宫对相应激素的敏感性。4 结论多玛绵羊发情季节血清中 GnRH、FSH、LH 和 TSH的浓度显著高于非发情季节，下丘脑 Kisspeptin 与KISS1R 在发情季节显著高于非发情季节；下丘脑-垂体组织中 GnRHR 基因，卵巢上 FSHR 和 LHR 基因，子宫内膜中 ER 和 PGR 基因的表达水平在发情季节显著高于非发情季节。且免疫组化得到相同的结论，发情季节卵巢切片上发育卵泡的数量显著多于非发情季节。说明多玛绵羊下丘脑-垂体-卵巢/子宫中主要生殖激素及其受体在发情季节的表达水平高于非发情季节。参考文献1 德庆卓嘎，央金，扎西，等.西藏多玛绵羊羊肉品质研究 J.家畜生态学报，2014，35（9）：78-82.2 央金，扎西，德庆卓嘎，等.西藏多玛绵羊羊毛品质研究进展 J.草食家畜，2012（3）：1-6.3 石达，蒋益民.西藏畜禽品种遗传资源 M.北京：中国农业大学出版社，2010：65-71.4 Johnston J D，Skene D J.60 years of neuroendocrinology：regulation ofmammalian neuroendocrine physiology and rhythms by melatonin J.J Endocrinology，2015，226（2）：187-198.5 Bittman E L，Dempsey R J，Karsch F J.Pineal melatonin secretiondrives the reproductive response to daylength in the ewe J.Endocri-nology，1983，113（6）：2276-2283.6 Malpaux B，Tricoire H，Mailliet F，et al.Melatoninandseasonalrepro-duction：understandingtheneuroendocrinemechanismsusingthesheepas a model J.Reprod Suppl，2002，59（1）：167-179.7 Maeda K I，Ohkura S，Uenoyama Y，et al.Neurobiological mechanismsunderlying GnRH pulsegeneration by thehypothalamus J.BrainRes，2010，1364（1364）：103-115.8 杨立，王青，王志，等.Kisspeptin 对下丘脑-垂体-卵巢轴的调控作用 J.中华生殖与避孕，2021，41（2）：177-183.9 贺建宁，王金鑫，狄冉，等.常年发情和季节性发情绵羊在不同季节生殖激素变化规律 J.畜牧兽医学报，2013，44（10）：1547-1553.10 Sogorescu E，Zamfirescu S，Anghel A H，et al.Seasonal variations ofprogesteronelevel and characteristics of breeding season and anoestrusperiod on Carpathian goats J.J Anim Vet Adv，2012，11（9）：1472-1477.11 Scaramuzzi R J，Baird D T.Pulsatile release of luteinizing hormoneand the secretion of ovarian steroids in sheep during anestrusJ.Endocrinolog，1977，101（6）：1801-1806.12 Xie Q Y，Kang Y F，Zhang C L，et al.The role of Kisspeptin in thecontrol of the Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis and reproductionJ.Front Endocrinol，2022，13：925206.https：/doi.org/10.3389/fendo.2022.925206.13安雪姣，赵生国，潘章源，等.绵羊 KISS1 基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析 J.中国畜牧杂志，2019，55（6）：45-50.14 Clarke I J，Smith J T，Caraty A，et al.Kisspeptin and seasonality insheep J.Peptides，2009，30：154-163.15Seminara S B，Messager S，Chatzidaki E E，et al.The GPR54 gene as aregulator of puberty J.N Engl J Med，2003，349（17）：1614-1627.16张小辉.MLT、LH 和 FSH 对绵羊季节性发情的调控作用研究 D.杨凌：西北农林科技大学，2004：36-37.17夏青，狄冉，刘艳琴，等.绵羊 TSHR 基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系 J.家畜生态学报，2020，41（3）：15-20.18ThomasES，FullerWB.Effectsof exogenousestradiol and progesteroneon plasma concentrations of leptin in ewes in non-breeding season J.Biology of Reproduction，1995，53：1527-1543.19Shlomit G，Eliezer S.Progesterone receptor profile in the decidua andfetal membrane J.Front Biosci，2007，1（12）：634-648.20 Bjelobaba I，Janjic M M，Tavcar J S，et al.The relationship betweenbasalandregulatedGnrhrexpressioninrodentpituitarygonadotrophinsJ.Mol Cell Endocrinol，2016，437：302-311.21Hiroshi K，Yoshikazu K，Fumiharu I，et al.Expression of the go-nadotropin receptors during follicular development J.Reprod MedBiol，2018，17：11-19.41