东海海参多糖酶解提取工艺优化及其抗氧化活性.pdf

食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术基金项目：浙江省基础公益研究计划项目（LGN20C200003）；温州市重点实验室（工程中心）建设项目（ZD202003）作者简介：徐仰丽（1981），女（汉），高级实验师，硕士，研究方向：水产加工。*通信作者：苏来金，副教授，博士，研究方向：海洋生物资源开发及利用。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.22.015东海海参多糖酶解提取工艺优化及其抗氧化活性徐仰丽1，刘温婷2，胡平霞2，苏来金2*（1.温州市农业科学研究院 温州市特色食品资源工程技术研究中心，浙江 温州 325006；2.温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325035）摘要：以东海海参（Acaudina leucoprocta）干品为原料，探究东海海参多糖的最佳提取工艺，并评价其基本组成及抗氧化活性。利用单因素试验考察木瓜蛋白酶的酶解温度、酶解时间、酶添加量、料液比对东海海参多糖提取率的影响，利用正交试验设计对工艺参数进行优化，利用红外光谱对得到的东海海参多糖进行鉴定，并检测东海海参多糖对DPPH 和 OH 的清除率，考察东海海参多糖的抗氧化性。结果表明，各因素对多糖提取率的影响大小顺序为酶添加量酶解时间酶解温度，优化的最佳提取工艺为料液比 120（g/mL）、酶解温度 55、酶解时间 5 h、酶添加量 1.0%，此条件下，东海海参多糖提取率为（11.850.27）%；东海海参多糖对 DPPH 和 OH 的清除效应随其浓度增加而提高。结果表明，东海海参多糖具有较强的抗氧化活性。关键词：东海海参；海参多糖；酶解工艺；红外光谱；抗氧化活性Enzymatic Extraction Process Optimization and Antioxidant Activity of Polysaccharides fromAcaudina leucoproctaXU Yangli1，LIU Wenting2，HU Pingxia2，SU Laijin2*（1.Wenzhou Research Center of Characteristic Food Resources Engineering and Technology，WenzhouAcademy of Agricultural Sciences，Wenzhou 325006，Zhejiang，China；2.College of Life and EnvironmentalScience，Wenzhou University，Wenzhou 325035，Zhejiang，China）Abstract：Polysaccharides were extracted from dried Acaudina leucoprocta，and the basic composition and antioxidant activity of the extracted polysaccharides were studied.The effects of enzymolysis temperature and time，enzyme（papain）concentration，andsolid-to-liquidratioontheyieldofA.leucoprocta polysaccharideswere investigated by single factor tests，and the extraction conditions were optimized by orthogonal design.The obtainedpolysaccharides were identified by infrared spectroscopy，and the scavenging rate on DPPH and OH free radicals were determined to evaluate the antioxidant activity of the polysaccharides.The results showed that the effects of different factors on the yield of polysaccharides followed the trend of enzyme concentration enzymatichydrolysis timeenzymatic hydrolysis temperature.The extraction conditions were optimized as hydrolysis with1.0%enzyme and solid-to-liquid ratio of 120（g/mL）at 55 C for 5 h.Under these conditions，the yield of A.leucoprocta polysaccharides was（11.850.27）%.The scavenging effects of A.leucoprocta polysaccharides onDPPHand OH free radicals increased in a concentration-dependent manner.The results indicated that A.leucoprocta polysaccharides had strong antioxidant activity.Key words：Acaudina leucoprocta；sea cucumber polysaccharide；enzymolysis；infrared spectrum；antioxidantactivity引文格式：徐仰丽，刘温婷，胡平霞，等.东海海参多糖酶解提取工艺优化及其抗氧化活性J.食品研究与开发，2023，44（22）：101-107.101食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术XUYangli，LIUWenting，HUPingxia，etal.EnzymaticExtractionProcessOptimizationandAntioxidantActivityofPolysaccharidesfrom Acaudina leucoproctaJ.Food Research and Development，2023，44（22）：101-107.东海海参，又名东海乌参，学名白肛海地瓜（Acaudina leucoprocta），属于海参纲，尻参科，海地瓜属。东海海参除了富含蛋白质、微量元素等营养成分，还富含海参多糖、海参皂苷等功能活性成分。东海海参在我国沿海的储量为 100 万 t，是目前我国储量最大的低值海参资源1-3，其价格低廉，与刺参相比，口感较差，加工困难4；另外，由于东海海参生活在浅海淤泥中，其体表形成了一层致密坚硬的表皮，重金属含量易超标，去除较困难5，导致东海海参没有得到很好的开发利用。近年来，海洋大陆架水质富营养化逐渐加剧6，东海海参大量繁殖，已经对海洋核电等设施造成了潜在威胁，若不能对东海海参资源进行有效清除或开发利用，未来可能存在生态安全隐患或造成海洋资源的浪费。研究表明，东海海参体壁中含有丰富的海参多糖7，包含海参酸性黏多糖和海参岩藻多糖两大类8-9，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等活性10-13。因此，提取东海海参中的海参多糖是提高东海海参开发利用程度、保障安全的重要途径之一，然而目前东海海参多糖的提取率不高，部分功能还不明确，给产业化应用带来了困难。本研究以东海海参干品为原料，采用酶解技术对东海海参多糖的提取工艺进行优化，对其结构和抗氧化活性进行研究，为低值海参资源的利用提供参考，并为东海海参多糖在食品和药品等领域的应用提供技术支持。1材料与方法1.1材料与试剂东海海参干品：温州冠佳食品有限公司。2021 年12 月捕捞于浙江沿海，清洗去内脏，海参体壁经冷风干燥制成干海参。丙酮、无水乙醇、苯酚、七水合硫酸亚铁、30%过氧化氢、葡萄糖、水杨酸、溴化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸（优级纯）：浙江中星试剂有限公司；木瓜蛋白酶（80 万 U/g）、风味蛋白酶（1.5 万 U/g）、中性蛋白酶（20 万 U/g）（均为食品级）：北京索莱宝科技有限公司；D-葡萄糖标准品（纯度 99.9%）：美国Sigma 公司。1.2仪器与设备DHG-9140A 恒温鼓风干燥箱：上海百典仪器设备有限公司；MKZA10-15JIV 超微粉碎机：日本増幸产业株式会社；FR124CN 电子分析天平（分度值 0.000 1 g）：上海书培实验设备有限公司；CT15RT 台式高速冷冻离心机：日本日立公司；HH-6 恒温水浴锅：苏州江东精密仪器有限公司；T6 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SpectraMax 190 全波长酶标仪：美国 MD 公司；Vertex 70 傅立叶红外光谱仪：德国布鲁克公司。1.3试验方法1.3.1原料预处理干东海海参试验前置于冰水中泡发 24 h，体壁剪成小块，置于 60 烘箱中烘至恒重，粉碎，过 80 目筛，制成东海海参体壁干粉，密封贮存于干燥器中备用。多糖提取前将海参干粉按照料液比 110（g/mL）置于95%丙酮溶液中，浸泡脱脂 24 h，自然晾干。1.3.2多糖含量测定采用苯酚-硫酸法14测定不同条件下所得的东海海参多糖含量。1.3.3酶解法提取东海海参多糖工艺的优化1.3.3.1最适蛋白酶的筛选以风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作为备选酶制剂，根据酶制剂说明书推荐条件略有改动，以5.00 g 东海海参干粉为原料，按照料液比 130（g/mL）加入去离子水，加底物质量 0.8%的酶，于水浴锅中酶解 6 h，酶解完成后，在 100 沸水中灭酶 15 min，冷却后将酶解液离心（4 000 r/min，15 min），收集上清液于50 mL 容量瓶中定容，每个处理重复 3 次，测定酶解液中多糖的含量，从而进一步确定后续试验所用的蛋白酶种类。1.3.3.2酶解法提取东海海参多糖的单因素试验精确称取东海海参干粉 5.00 g 为底物，考虑到东海海参多糖提取反应初始溶液为中性条件，木瓜蛋白酶最适 pH 值为 67，因此，本研究固定了 pH7.0 进行单因素试验，以木瓜蛋白酶酶解过程中酶解温度、酶解时间、酶添加量和料液比为考察因素，每个因素选取 5 个水平，每个处理重复 3 次，测定酶解液中海参多糖含量，计算多糖提取率。酶解温度：底物按照料液比 130（g/mL）加入去离子水，加底物质量 0.8%的试验用酶，分别以酶解温度30、40、50、60、70，置于水浴锅中酶解 6 h，考察酶解温度对多糖提取率的影响。酶解时间：底物按照料液比 130（g/mL）加入去离子水，加底物质量 0.8%的试验用酶，以 50 作为酶解温度，置于水浴锅中分别酶解 2、4、6、8、10 h，考察酶解时间对多糖提取率的影响。102食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术酶添加量：底物按照料液比 130（g/mL）加入去离子水、分别加入底物质量 0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的试验用酶，置于 50 水浴锅中酶解 6 h，考察酶添加量对多糖提取率的影响。料液比：底物分别以 110、120、130、140、150（g/mL）的料液比加入去离子水，加底物质量 1.0%的试验用酶，置于 50 水浴锅中酶解 6 h，考察料液比对多糖提取率的影响。1.3.3.3酶解法提取东海海参多糖的正交试验在单因素试验的基础上，以东海海参多糖提取率为试验指标，选取酶解温度、酶解时间、酶添加量为影响因素，设计三因素三水平的正交试验，利用 L9（33）正交试验表进行正交试验，正交试验因素与水平见表1，每个处理重复 3 次。1.4东海海参多糖的红外光谱分析取干燥的试验提取多糖，参考文献15的方法，加入溴化钾后压片，在 4 000400 cm-1内扫描红外光谱。1.5东海海参多糖的抗氧化性测定1.5.1东海海参多糖对 DPPH 的清除作用DPPH 的清除能力参考马士超等16的测定方法。DPPH 清除率（X，%）计算公式如下。X=1-A1A00?100式中：A1为多糖溶液的吸光度；A0为对照溶液的吸光度。1.5.2东海海参多糖对 OH 的清除作用测定 OH 的清除能力参考 Chen 等17的测定方法。OH清除率（Y，%）计算公式如下。Y=A1-（Am-An）A1100式中：A1为空白对照的吸光度；Am为多糖溶液的吸光度；An为样品对照的吸光度。1.6数据处理测定结果均作 3 次平行处理，利用 SPSS Statistics21.0 和 Excel 2016 对试验数据进行处理分析，结果以平均值标准差表示，并利用 Origin 2021 进行图表绘制，方差分析采用（one-way AVONA）进行显著性检验，p0.05 表示差异显著。2结果与分析2.1葡萄糖标准曲线的制作多糖含量在 0100 g/mL 范围内与吸光度（=490 nm）呈现良好的线性关系，回归方程为 Y=0.0101X+0.003 4，r2=0.999 0，符合标准曲线的准确度要求。2.2蛋白酶种类对东海海参多糖提取率的影响取相同量的东海海参干粉，对不同蛋白酶的酶解效果进行评定，以酶解液多糖提取率为指标，进行最适蛋白酶的筛选，结果见表 2。海参多糖主要是蛋白多糖，其中的蛋白包括和多糖连接的核心蛋白以及游离蛋白，在多糖提取过程中，切断多糖与核心蛋白之间的糖肽键进而水解蛋白质，释放出多糖链18-19。由表 2 可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液多糖提取率显著高于风味蛋白酶（p0.05），故这两种酶的提取效果接近，但考虑到酶制剂的成本和应用，选取木瓜蛋白酶进行后续步骤的酶解工艺优化。2.3东海海参多糖提取的单因素试验结果2.3.1酶解温度对东海海参多糖提取率的影响酶解温度对东海海参多糖提取率的影响见图 1。从图 1 可以看出，东海海参多糖的提取率随着酶解温度的提高呈现先上升后下降的趋势，在酶解温度表 1正交试验因素与水平Table 1Factors and levels of orthogonal test水平因素A 酶解温度/B 酶解时间/hC 酶添加量/%14550.925061.035571.1表 2最佳蛋白酶筛选结果Table 2Results of optimal protease screening序号酶的种类酶解温度/酶解时间/h酶添加量/%pH 值多糖提取率/%1风味蛋白酶4560.87.04.300.02b2木瓜蛋白酶5060.87.05.980.02a3中性蛋白酶5060.87.06.100.03a注：同列不同字母表示差异显著（pBA，即为酶添加量酶解时间酶解温度。对正交试验进行多因素方差分析，结果见表 4。由表 4 可知，酶添加量对多糖提取率的影响最为突出，酶解温度对多糖提取率的影响最小，根据 F 值的大小，得到的各因素主次关系为酶添加量酶解时间酶解温度，这与极差分析所得结果一致。可能是由于设定的 3 个温度水平均在该木瓜蛋白酶适宜作用温度范围，使得该次试验中酶解温度的影响效应最小，因此优化的提取工艺为料液比 120（g/mL）、酶解温度55、酶解时间 5 h、酶添加量 1.0%。2.5验证试验为了检验所得最佳提取工艺的稳定性及可靠性，精确称取东海海参干粉 5.00 g，以上述得到的最佳提取工艺进行试验验证。重复 3 次平行，得到的东海海参多糖平均提取率为（11.850.27）%，大于正交试验方案中的最高值（11.75%0.16）%，说明该工艺具有良好的稳定性和可靠性。2.6东海海参多糖的红外光谱分析按照前述优化的提取工艺，对提取的东海海参多糖进行红外分析，结果见图 5。从图 5 可以看出，在 3 360 cm-1处出现了 1 个较强伸缩振动峰，这是由于 OH 的伸缩振动形成的，是多糖的特征吸收峰27，表明样品中具有糖环羟基；而在2 9692 936 cm-1处有 1 个弱带，表明具有 C-H 伸缩振动，这是多糖的次甲基 CH 振动吸收峰。另外在1 656 cm-1处的伸缩振动峰，与由 CO 键的存在相关；而在 1 242 cm-1的特征峰的产生则是与 SO 键的存在有关，说明该多糖含有硫酸基。在 850 cm-1处是COS 的振动吸收峰，表明硫酸基在糖上的位置为C4 位。在 1 0801 029 cm-1和 1 2421 080 cm-1的特征峰，这是由醚键 COC 振动而产生的吸收峰表明多糖样品含有吡喃糖环。在 890 cm-1处的吸收峰微弱，表明样品中含有少量 型糖苷键，据此推断，该优化方法提取的东海海参多糖是一个典型的-D-吡喃型多糖，这与 Dong 等28从东海海参、黑乳参中提取的多糖的类型基本一致。2.7东海海参多糖的抗氧化性分析2.7.1东海海参多糖对 DPPH 的清除能力分析东海海参多糖对 DPPH 的清除能力测定结果如图 6 所示。DPPH 是一个比较稳定的基团，能够较好反映被测表 3正交试验方案设计及结果Table 3Design and results of orthogonal test表 4正交试验结果方差分析Table 4Analysis of variance of orthogonal test results方差来源 离差平方和自由度均方F 值pA1.34320.6714.6510.177B3.27421.63711.3390.081C3.63521.81712.5880.074误差0.28920.144图 5东海海参多糖红外光谱扫描图Fig.5IR spectrum of polysaccharides from Acaudina leucoprocta波数/cm-1透光率/%4 0001 0001 5002 0002 5003 0003 5005001059075604530153 3601 6562 9362 9691 5441 4001 0291 2421 4501 080576678851图 6东海海参多糖 DPPH 清除率Fig.6DPPH scavenging rate of polysaccharides from Acaudinaleucoprocta27$%11)e#K(UNHN-U105食品研究与开发23 年 11 月第 44 卷第 22 期应用技术溶液的抗氧化活性，清除 DPPH 的作用主要取决于抗氧化剂的供氢能力，被广泛用于抗氧化剂对自由基的清除活性的评价29。由图 6 可以看出，在 01.0 mg/mL浓度内，随着东海海参多糖浓度的增加，其清除DPPH 的效果逐渐增强，且具有明显的剂量关系，当多糖质量浓度提高到 1.0 mg/mL 时，东海海参多糖对DPPH 的清除率达到（78.554.89）%，此时，阳性对照VC的 DPPH 的清除率为（90.432.87）%，说明东海海参多糖具有较好的清除 DPPH 能力。2.7.2东海海参多糖对 OH 的清除作用分析东海海参多糖对 OH 的清除能力测定结果如图 7所示。生物体内 OH 是最具代表的自由基，可能导致生物体内蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等大分子物质的破坏，从而加速生物体的老化30。由图 7 可知，在多糖浓度为 0.11.0 mg/mL 时，随着东海海参多糖质量浓度的增加，清除 OH 的效果逐渐增强，当质量浓度为1.0 mg/mL 时，清除率达到（82.712.81）%，阳性对照 VC的 OH 清除率为（94.682.67）%，这表明东海海参多糖具有良好的 OH 清除活性。海参多糖占干海参的 6%以上，是海参的主要活性物质之一，其生物学活性主要取决于海参的结构，而海参的结构主要受到海参品种、分子量大小、提取方法等影响31。Mou 等32对墨西哥海参的研究表明，分支硫酸化模式为-L-Fuc4S 的 fCS-Am 抗氧化活性最强，经过降解后的低分子质量多糖的自由基清除能力比未降解多糖有所降低。本研究中东海海参多糖具有较好的抗氧化活性，这可能与本研究优化的酶解工艺有关系。3结论采用木瓜蛋白酶酶解法提取东海海参多糖，得到最佳提取工艺为料液比 120（g/mL）、酶解温度 55、酶解时间 5 h、酶添加量 1.0%，在此条件下东海海参多糖提取率为（11.850.27）%，且各因素对多糖提取率的影响程度为酶添加量酶解时间酶解温度。最优工艺提取的东海海参多糖具有典型的-D-吡喃型多糖特征。东海海参多糖对 DPPH 和 OH 的清除率均随多糖浓度升高而升高，具有明显的剂量关系且具有良好的抗氧化能力。本研究可为东海海参多糖的提取和功能成分的开发应用提供参考。参考文献：1徐仰丽,苏来金,杨会成,等.东海海参性腺丙酮提取物的体外功能活性分析J.食品与发酵工业,2020,46(2):120-125.XU Yangli,SU Laijin,YANG Huicheng,et al.The functional effectsof extraction with acetone form Acaudina molpadioidea gonad in vitroJ.Food and Fermentation Industries,2020,46(2):120-125.2徐彩云,苏秀榕,李妍妍,等.海地瓜的营养成分及其降血脂功能J.营养学报,2009,31(4):384-387.XU Caiyun,SU Xiurong,LI Yanyan,et al.The nutrients constituents of Acaudina leucoprocta and its hypolipidemic effectJ.Acta Nutrimenta Sinica,2009,31(4):384-387.3于平,易明花,黄星星,等.东海海参胶原蛋白酶解物的制备与抗氧化活性及其对神经细胞损伤的保护作用J.中国食品学报,2018,18(12):89-98.YU Ping,YI Minghua,HUANG Xingxing,et al.Preparation of Acaudina molpadioides collagen hydrolysates and their antioxidantactivity and protective effect on injured nerve cellsJ.Journal ofChinese Institute of Food Science and Technology,2018,18(12):89-98.4李卓,田迎樱,李媛媛,等.低值海参促进小鼠骨折愈合及机制研究J.中国食品学报,2022,22(1):88-97.LI Zhuo,TIAN Yingying,LI Yuanyuan,et al.Acaudina molpa dioidea promotes fracture 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