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<p>分子生物学复习资料
（第一版） &nbsp;

一 名词解释

1 &nbsp;Southern blot / Northern blot — DNA斑迹法 / RNA转移吸印技术。是为了检测待检基因或其表达产物的性质和数量（基因拷贝数）常用的核酸分子杂交技术。二者均属于印迹转移杂交术，所不同的是前者用于检测DNA样品；后者用于检测RNA样品。

2 &nbsp;cis-acting element / trans-acting factor — 顺式作用元件 / 反式作用因子。均为真核生物基因中的转录调控序列。顺式作用元件是与结构基因表达调控相关、能被基因调控蛋白特异性识别和结合的特定DNA序列，包括启动子和上游启动子元件、增强子、反应元件和poly（A）加尾信号。反式作用因子是能与顺式作用元件特异性结合、对基因表达的转录起始过程有调控作用的蛋白质因子，如RNA聚合酶、转录因子、转录激活因子、抑制因子。

3 VNTR / STR — 可变数目串联重复序列 / 短串联重复。均为非编码区的串联重复序列。前者也叫高度可变的小卫星DNA，重复单位约9～24bp,重复次数变化大,变化高度多态性；后者也叫微卫星DNA，重复单位约2～6 bp，重复次数约10～60次，总长度通常小于150bp 。 &nbsp; &nbsp; （参考第7题）

4 &nbsp;viral oncogene / cellular oncogene — 病毒癌基因 / 细胞癌基因。病毒癌基因指存在于逆转录病毒中、体外能使细胞转化、体内能导致肿瘤发生的基因；细胞癌基因也叫原癌基因，指存在于细胞内，与病毒癌基因同源的基因序列。正常情况下不激活，与细胞增殖相关，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。

5 &nbsp;ORF / UTR — 开放阅读框 / 非翻译区。均指在mRNA中的核苷酸序列。前者是特定蛋白质多肽链的序列信息，从起始密码子开始到终止密码子结束，决定蛋白质分子的一级功能；后者是位于前者的5＇端上游和3＇端下游的、没有编码功能的序列，主要参与翻译起始调控，为前者的多肽链序列信息转变为多肽链所必需。

6 &nbsp;enhancer / silencer — 增强子 / 沉默子。均为顺式作用元件。前者是一段含多个作用元件的短DNA序列，可特异性与转录因子结合，增强基因的转录活性，可以位于基因任何位置，通常在转录起始点上游-100到-300个碱基对处；后者是前者内含的负调控序列，结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。

7 &nbsp;micro-satellite / minisatellite — 微卫星DNA / 小卫星DNA 。卫星DNA是出现在非编码区的串联重复序列，特点是有固定重复单位且重复单位首尾相连形成重复序列片段，串联重复单位长短不等，重复次数大小不一。微卫星DNA即STR；小卫星DNA分为高度可变的小卫星DNA（即VNTR）和端粒DNA。 &nbsp; &nbsp; &nbsp;（参考第3题）

8 &nbsp;SNP / RFLP — 单核苷酸多态性 / 限制性片段长度多态性。 前者是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上；后者是由于高度重复序列中的无间隔反向重复序列容易形成也容易突变产生或缺失一个酶切位点，所造成的限制性片段长度多态性，如果用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，会产生长度不同的DNA片段。

9 &nbsp;cloning vector / expressing vector — 克隆载体 / 表达载体。载体是与外源性DNA片段在体外连接构成重组分子，然后导入宿主细胞，使外源性DNA扩增或表达的分子。克隆载体是用于克隆和扩增特定DNA片段的载体；表达载体是用于表达外源基因的载体。

10 &nbsp;optional exon / optional intron — 外显子选择 / 内含子选择。均属于mRNA的选择剪接方式。选择剪接指参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留的剪接方式。外显子选择指在不同剪接方式中，某个或某几个外显子可以在成熟mRNA中保留，也可以通过剪接过程被去掉；内含子选择指在不同剪接方式中，内含子可以被完全去掉，也可以有一个内含子被保留在成熟mRNA中。

11 &nbsp;promoter / terminator — 启动子 / 终止子。均为真核生物基因两侧不能被转录且对基因表达、调控有重要作用的序列。启动子是能与RNA聚合酶结合并起始转录的核苷酸序列，包括TATA盒、CAAT盒、GC盒一组序列，一般位于基因转录起始点上游-100～-200碱基对范围；终止子是提供转录停止信号的DNA序列，当mRNA转录到此部位后，产生poly(U),被结合在RNA聚合酶上的延长因子识别并与其结合，促使RNA聚合酶与DNA模板解离，终止转录。

12 &nbsp;leader sequence / SD sequence — 前导序列 / SD序列。前导序列指位于基因5＇端、第一个外显子上游的序列，也叫5＇端序列，在加工过程中通常被最先剪切去除；SD序列指位于原核生物mRNA5＇端，与核糖体16S rRNA结合的序列，一般位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处,并且同16S rRNA 3＇端的序列互补，其顺序及位置影响翻译起始效率。

13 &nbsp;gene / genome — 基因 / 基因组。基因是负责编码RNA或一条多肽链的DNA片段，即携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位；基因组是一个细胞或病毒的全部遗传信息，真核生物基因组是一套完整单倍体DNA和线粒体DNA全部序列，某些病毒基因组由RNA组成。

14 &nbsp;operon / operator — 操纵子 / 操纵元件。操纵子是指按功能相关性成簇排列的结构基因，连同上游调控区和下游转录终止信号，共同组成的一个基因表达协同单位；操纵元件是一段能被不同基因表达调控蛋白识别和结合的DNA序列，是决定基因表达效率的关键元件。

15 &nbsp;gene rearrangement / gene replacement — 基因重排 / 基因置换。基因重排是DNA水平调控的重要方式之一，指某些基因片段改变原来存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，再重排位一个完整的转录单位；基因置换是重要的基因治疗方式，指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷。

16 &nbsp;domain / motif — 结构域（功能域） / 基序（模序）。

17 &nbsp;receptor / adaptor — 受体 / 衔接蛋白。受体是信息分子的接收分子，是存在于细胞表面的或细胞内的蛋白分子，其作用是识别配体并将配体信号进行转换，使之成为细胞内分子可以识别的信号并传递至其他分子引起细胞应答；衔接蛋白是信号转导通路中不同信号转导分子的接头，可将位于其上游与下游的信号转导分子连接起来。

18 &nbsp;initiator caspase / effector caspase — 起始者胱天蛋白酶 / 效应者胱天蛋白酶。胱天蛋白酶是哺乳动物细胞凋亡的关键酶。起始者胱天蛋白酶有较长原域，位于胱天蛋白酶级联活化途径上游，通过蛋白质相互作用自我激活；效应者胱天蛋白酶有较短原域，位于胱天蛋白酶级联活化下游，前体能被起始者胱天蛋白酶切割而活化，活化后能切割底物从而导致凋亡。

19 &nbsp;transfection / transformation — 转染 / 转化。均为重组DNA常用方法。前者指真核细胞主动摄取或被动导入外源性DNA片段而获得新表型的过程；后者指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌并使其获得新表型的过程。

20 &nbsp;gene family / gene superfamily — 基因家族 / 基因超家族。基因家族指核苷酸序列或编码产物结构具有一定程度同源性的基因，其编码产物常常有相似功能；超基因家族是由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族，它们结构有程度不等的同源性，但功能不一定相同。

二 问答
1 &nbsp;基因的基本概念。
答：基因的基本概念包括基因，基因组，结构基因，模板链，编码链，外显子，内含子，顺式作用元件，反式作用元件，启动子，增强子，终止子等。(参考名词解释)
结构基因 — 基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。
模板链/编码链 — 结构基因双链中一条作为合成RNA的模板链，另一条为编码链。
外显子/内含子 — 编码序列 / 非编码序列。

2 &nbsp;基因的组织结构。
答：原核生物基因结构简单，通常是一条双链环状DNA分子，有操纵子结构。
真核生物基因结构复杂，包括染色体DNA和线粒体DNA。染色体DNA位于细胞核内，双链盘绕在以组蛋白分子为核心的结构表面构成核小体，核小体组成染色单体；线粒体DNA是闭环双链分子，位于核外。
病毒基因可以由DNA或RNA组成。RNA病毒基因有单双链和正负链之分，DNA病毒基因有环状DNA和线性DNA之分。

3 &nbsp;原核生物、真核生物、人类基因组结构特点。
答：原核生物的基因组结构特点：①环状双股链，②有操纵子结构，③序列连贯，无内含子，
④大多为结构基因，⑤无重叠序列，⑥大多为单拷贝。
&nbsp;真核生物基因组结构特点：①基因组大，②核内染色体，③体细胞基因组为双倍体，④大量重复序列，⑤结构基因不连续，⑥断裂基因，含外显子与内含子，⑦绝大多数为非编码序列。
&nbsp;人类基因组结构特点：人类基因组除包括真核生物基因组结构特点外，数量更大，非编码序列更多。与细菌基因组相比，基因组大1000倍，基因数目多20倍，非编码序列为10000倍。

4 &nbsp;重复序列种类、特征，人类基因多态性。
答：重复序列大部分是非编码序列，功能主要与基因组稳定性、组织形式及基因表达调控有关。根据重复序列出现频率不同，可分为高重复序列DNA（&gt;105）、中重复序列DNA（10～105）、单拷贝或低重复序列DNA（&lt;10）。 高重复序列可以集中在某一区域串联排列。典型高重复序列DNA有卫星DNA和反向重复序列。卫星DNA出现在非编码区呈串连重复排列，按照串连重复单位和重复次数，分为大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。反向重复序列指两个顺序相同的拷贝在DNA链上反向排列，中间可以有间隔序列，也可以串联（回文结构）。 中重复序列散在分布于基因组中，常与单拷贝基因间隔排列。
人类基因多态性是指人类个体之间基因组DNA的差异，这些差异产生的主要原因是基因组序列的变异。变异是生物遗传基本特征之一，也是生物进化和适应环境的必然结果。基因多态性造成了生物特别是人类在生理及病理条件下对疾病、环境及应激的易感性、对环境、毒素、药物的耐受性和反应性的千差万别。

5 &nbsp;病毒基因组、原核生物基因组、真核生物基因组核酸复制特点。
答：DNA复制基本特点：①复制都有固定起始点，②复制过程中形成复制泡和复制叉，③复制基本单位是复制子，④复制是半保留复制，保证遗传信息忠实传递，⑤复制是半不连续复制，克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约。
&nbsp;原核生物有特定复制起点和终点结构，只有一个复制起点；在起始点上可以连续开始新的复制；复制过程都是DNA双链复制，也有Θ复制、滚环复制、D环复制等方式。
&nbsp;真核生物复制需要解开和重装核小体结构；复制过程中的引物及冈崎片断长度小于原核生物；有多个复制位点；需要特殊机制复制端粒，涉及逆转录；一次复制完成以前不会启动新一轮复制；线粒体DNA以D环模式进行复制。
&nbsp;不同病毒的基因组核酸以不同模式进行复制。单链环状DNA可通过成环滚环模式复制，双链环状DNA可通过不同方式复制，有些病毒双链环状DNA通过RNA中间体进行复制，病毒线性DNA利用特殊末端起始引物复制，RNA病毒通过RNA复制过程复制。

6 &nbsp;DNA损伤及其修复的主要方式。
答：DNA损伤形式有：交联、DNA链断裂、碱基突变、DNA重组等。
① 交联包括链内共价交联(碱基之间)和链间共价交联（链与链之间）。
② DNA链断裂指DNA链内磷酸二酯键断裂。
③ 碱基突变包括单点突变和多点突变。点突变分为转换（同型碱基替代）和颠换（异型碱基替代），此外还有缺失（核苷酸丢失）、插入（核苷酸增加）、倒位（核苷酸序列方向倒转）。
④ DNA重组指DNA分子内发生较大片段的交换。
DNA损伤修复机制有：
① 直接修复。如：DNA断裂口在链两端未损伤情况下可由连接酶直接修复，二聚体可被光复活酶直接修复，烷基化碱基可直接修复。
② 切除修复。可分为单个核苷酸切除修复和核苷酸片段切除修复。
③ 重组修复。即先进行复制再进行切除修复。
④ SOS修复。是DNA损伤严重时的应急性修复方式。
⑤ 细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制。

7 &nbsp;原核生物基因表达转录环节的调控模式、调控方式。
答：基因表达调控的环节，主要在转录水平。多种因素以特定的方式影响转录。
① 启动子决定转录的效率与方向及模板链。
② σ因子的种类与浓度调节基因的表达。
③ 负调控：阻遏蛋白结合于DNA后抑制转录，分为诱导和阻遏2种情况。
④ 正调控：调控蛋白结合于特定DNA序列后促进基因的转录。CAP蛋白调节糖代谢相关基因的表达；ntrC蛋白调节氮代谢相关基因的表达。
⑤ 倒位蛋白通过DNA重组倒位调节基因表达。
⑥ RNA聚合酶抑制物可与RNA结合并抑制转录。
⑦ 衰减子减弱转录。

8 &nbsp;真核生物基因表达各环节的基本要素。真核生物基因表达调控的环节及其主要特征。
答：真核生物基因表达共有7个环节：
① 转录起始。RNA聚合酶在转录因子帮助下识别和结合启动子，形成转录起始复合物。
② RNA延伸。RNA聚合酶开始依碱基配对关系按模板链碱基序列加入核糖核苷酸。
③ 转录终止。RNA聚合酶ⅠⅢ均有对应的终止信号，RNA聚合酶Ⅱ没有明确中止信号。
④ 转录产物的加工。mRNA前体加工：5`端加帽→3`端加尾→剪接→化学修饰→编辑;
tRNA前体加工：剪接去除内含子→剪切5`端先导序列→添加或修复3`端CCA→化学修饰。
rRNA前体加工：前体剪接→化学修饰。
⑤ RNA跨核膜运输。mRNA与多种蛋白质合成核蛋白颗粒，rRNA前体在核仁合成并被加工成熟后，与核糖体蛋白形成核糖体，从胞核运到胞质。
⑥ 翻译。翻译起始阶段：起始复合物前体形成→起始复合物前体与mRNA结合形成起始复合物→40亚基―Met―tRNA复合物沿mRNA扫描→40亚基―Met―tRNA复合物识别密码子。
延长阶段：氨基酸活化与搬运→延长因子→肽链延伸（进位、转态、移位）。
&nbsp; &nbsp;终止阶段：释放因子RF识别终止子。
⑦ 翻译后加工。肽链折叠、肽链中氨基酸共价修饰、肽链水解修饰、亚单位聚合。
真核生物基因表达的调控是多级调控，可发生在：DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平。
① DNA水平：基因丢失、基因扩增与放大、基因重排、低甲基化、转座与致癌基因的表达。
② 转录水平：转录起始复合物的形成是转录可调控环节、反式作用因子是真核细胞重要基因表达调控蛋白、转录起始是由多种激活的反式作用因子复合调控。
③ 转录后水平调控：5`端加帽和3`端加尾有调控意义、mRNA的选择剪接可调控基因表达、mRNA运输控制调节进入细胞质的mRNA量。
④ 翻译水平：某些mRNA翻译起始可受特定因素调控、mRNA稳定性调节蛋白质合成水平、小分子mRNA可调控翻译效率。
⑤ 翻译后水平：新生肽链水解影响蛋白质含量、肽链中氨基酸共价修饰是快速调节方式、通过信号肽分拣、运输、定位影响蛋白质功能发挥。

9 &nbsp;蛋白质翻译后修饰方式及其生物学意义。
答：蛋白质翻译后需要不同形式的共价修饰，才能有生物学活性。
① 新生肽链N端的甲硫氨酸在翻译后被切除。
② 蛋白前体经酶切修饰，激活成为功能蛋白质。
③ 磷酸化－去磷酸化修饰，决定磷蛋白的活性状态。
④ 糖基化修饰，包括N糖基化和O糖基化，是许多真核蛋白质产生生物学活性必要条件。
⑤ 脂酰化修饰，使特定蛋白质定位于膜的周边。
⑥ 乙酰化－去乙酰化修饰，可调节蛋白质的活性。
⑦ 二硫键的形成，使蛋白质的立体结构更稳定。
⑧ 金属离子的结合，通常是酶活性中心的必需部分，参与酶的催化作用。
⑨ 蛋白质异常修饰，与疾病密切相关。如：组蛋白乙酰化异常与肿瘤密切相关。

10 &nbsp;蛋白质分子在细胞内降解的决定性因素、降解途径。
答：蛋白质分子在细胞内的降解取决于其末端和内部序列。N末端有选择性降解信号，即N末端氨基酸，分为去稳定残基和稳定残基，决定着蛋白质的半衰期，有些降解信号可能是一段保守序列。
&nbsp; &nbsp;降解途径有：溶酶体途径、特殊细胞器内水解系统、细胞膜表面水解体系、内质网相关蛋白降解途径（ERAD）、泛素－蛋白酶体途径（UPP）。ERAD和UPP称为泛素－蛋白酶复合体途径。在UPP途径中，蛋白质降解前要泛素化，然后被26S蛋白酶体降解；在ERAD途径中，内质网正确识别错误折叠的蛋白质，将其逆向转运到细胞浆，再被泛素－蛋白体酶体系降解。

11 &nbsp;细胞信号转导基本概念、主要途径、主要特点，G蛋白偶联受体信号转导途径基本要素。
答：细胞信号转导是细胞针对外源信息发生的细胞应答反应全过程，即细胞识别各种外来理化信号，将其转变为细胞内各种分子活性的变化，从而改变细胞内某些代谢过程、影响细胞生长速度甚至诱导死亡的过程。
信号转导主要途径：①G蛋白介导的细胞信号转导途径：腺苷酸环化酶途径，IP3、Ca 2+-钙调蛋白激酶途径，DG-蛋白激酶C途径。 &nbsp; ②酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导途径。
③核受体及其信号转导途径。 &nbsp; &nbsp;④鸟苷酸环化酶信号途径。
G蛋白偶联受体信号转导途径基本模式：配体与受体结合→受体活化G蛋白→G蛋白激活或抑制效应分子→效应分子改变第二信使含量与分布→第二信使作用于相应靶分子改变其构象，改变细胞代谢及基因表达。

12 &nbsp;细胞周期基本概念，Cyclin、CDK、CKI的主要种类及其在细胞周期调控中的作用。
答：细胞周期是指细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的一个有序过程。包括间期和分裂期，间期包括G1 期、S期、G2 期；分裂期包括前期、中期、后期、末期。
Cyclin种类
A
B
C
D
E
功能
S期和G2/M转换
G2/M

G1期
G1/S转换

CDK
功能
CDK1
G2/M转换 、有丝分裂
CDK2
G1 期 、S期 、G1/S转换
CDK3
G1/S转换
CDK4
G0/ G1转换 、G1/S转换
CDK5
神经纤维磷酸化
CDK6
G0/ G1转换 、G1/S转换
CDK7
CDK2－6活化所需要
CDK8
转录
CDK9
转录

CKI
INK4家族
功能
CIP/KIP家族
功能
INK4a(p16)
维持细胞正常生长必需、肿瘤抑制、诱导复制衰老、抑制端粒酶活性、抑制细胞生长。
P21
DNA损伤反应时G1期停滞、G2/M转换
INK4b(p15)
诱导复制衰老、抑制端粒酶活性、抑制细胞生长。
P27
G1期停滞、抑癌
INK4c(p18)

P57
生长发育中起细胞增长相反作用
INK4d(p19)

13 &nbsp;细胞凋亡的基本概念、主要功能形态特征、几种主要的凋亡诱导信号通路及其特点。
答：细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程，其发生受到机体严密调控。
形态特征为细胞皱缩、胞浆失水浓缩，胞膜完整、泡状，凋亡后期内裹核物质和细胞器形成凋亡小体，核膜完整、核皱缩，染色质固缩聚集核膜下、最后裂解为碎片，细胞器大多完整、线粒体肿胀、通透性增加、释放细胞色素。生物化学特征为DNA在核小体连接处断裂形成连续阶梯状小片段；凋亡相关蛋白质和酶活化；凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻；ATP正常合成并分解供能。
&nbsp;细胞凋亡诱导信号通路有外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径。前者由死亡受体与相应配体结合组装DISK，诱发caspase 8前体活化，导致下游效应者光天蛋白酶活化，切割底物使细胞凋亡；后者是由于生长因子不足，细胞脱离原来环境或DNA损伤等诱发，由Bcl－2家族中促凋亡因子使细胞色素C从线粒体释放入胞浆，与Apaf1、ATP/dATP形成凋亡体，凋亡体活化caspase 9前体，caspase 9下游途径与死亡受体途径相同。

14 原癌基因的概念、分类、激活机制，抑癌基因的基本概念、常见抑癌基因的基本功能。
答：原癌基因，指存在于细胞内，正常情况下不激活，与细胞增殖相关，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守的序列。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。
原癌基因按生化功能分为三类：①蛋白激酶类生长因子，②G蛋白、及与其活性相关的蛋白质，③核内转录因子。
活化机制有5种：①点突变，②基因扩增，③基因重排，④染色体易位，⑤病毒基因启动子及增强子的插入。
抑癌基因是一类抑制细胞增生，从而抑制肿瘤形成的隐性基因。
抑癌基因功能：①RB和p53基因调节细胞周期关卡，②抑癌基因通过调节信号转导而抑制细胞生长，③DNA修复基因维持基因组稳定。

15 重组DNA技术中常用工具酶的主要特点和用途，RE的命名、分类及其活性影响因素。
答：基因克隆中最主要的工具酶有：
①限制性核酸内切酶，用于切割DNA，识别双链DNA分子内部特异位点裂解磷酸二酯键。
②DNA聚合酶，用于合成DNA。 &nbsp; &nbsp;③逆转录酶，以RNA为模板合成cDNA。
④T4 DNA连接酶，催化DNA片断连接。 &nbsp;⑤碱性磷酸酶，去除核酸末端磷酸。

限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜体)代表微生物种名。接下来的字母代表寄主菌的株或型。如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。

16 &nbsp;基因工程载体基本概念、基本条件，基因工程常用载体的特点及主要用途。
答：载体：携带靶DNA片段（外源DNA片段）进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA片段（目的基因），以便进一步研究其结构和功能。
表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA，进而合成相关蛋白质。
载体基本条件： &nbsp;①能自主复制； &nbsp;②具备筛选标记；
③适当大小的分子量和适当限制性内切酶酶切位点； &nbsp; &nbsp;④在细胞中拷贝数高；
⑤应配备有与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、加尾信号、增强子等调控DNA元件
常用的载体：质粒、噬菌体、病毒载体等
①质粒载体。用途：保存和扩增片段小于2kb的DNA、构建cDNA文库、目的DNA测序、制备探针。 特点：分子量较小，能在细菌内稳定存在；具有多个遗传标志，能对宿主细胞选择；具有多个限制性内切酶单一切点，便于外源基因插入。 缺点：所能接受的DNA片段容量小；转化效率低。
②噬菌体载体，包括插入型载体和置换型载体。用途：重要的基因组文库和cDNA文库克隆载体。 &nbsp;优点：能携带的外源DNA片段更长，感染能力也大于质粒载体。缺点：进行真核基因组文库构建时，其容量仍然受到一定的限制。
③粘粒载体。用途：根据载体携带的抗药性标记筛选阳性克隆细胞株。 &nbsp;特点：含质粒抗药性标记和自主复制成分，可在细菌内大量扩增；带粘性末端区，可体外包装；有多个限制性内切酶酶切位点；本身不大；重组体的本底很低，有利于筛选。
④BAC。特点：与标准质粒载体相似，但有不同的ori和编码ori蛋白的F因子、可容纳大于300kb的外源DNA、重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞、进入细胞的拷贝数低。
⑤YAC。用途：人类基因组计划中作物理图的工具。 优点：酵母是真核细胞能克隆真核基因序列尤其是重复序列、能克隆很大的DNA片段（2Mb）。 缺点：转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。

17 &nbsp;真核生物基因转染的常用方法及其原理。
答：①磷酸钙共沉淀法。将外源DNA或重组质粒DNA与CaCl2溶液混合后形成DNA-磷酸钙微小颗粒加入到宿主细胞培养基，颗粒沉淀到细胞表面被宿主摄取，将DNA导入细胞。
②电穿孔法。将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现很多小孔，使外源DNA进入宿主细胞。
③DEAE-葡聚糖法。将外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带大量正电荷化学基团，可与DNA带负电荷磷酸基团结合，黏附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外援DNA进入细胞。
④脂质体。阳离子脂质体试剂与DNA混合后形成稳定脂质双层复合物，加入培养细胞，脂质体可直接与细胞融合，DNA被释放到胞浆。
⑤显微注射法。将外源基因通过毛细玻璃管在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核。

18 &nbsp;PCR技术的基本原理、反应体系构成及其优化，PCR优化的条件，主要应用。
答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`端和3`端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。
参与PCR反应体系的因素：①模板核酸；②引物；③缓冲液④Tag DNA聚合酶；
⑤Mg 2＋；⑥dNTP；⑦反应温度与循环次数；⑧PCR仪等。
应用：①目的基因克隆，②基因体外突变，③DNA微量分析④mRNA含量分析。可应用于遗传病的基因诊断；肿瘤的诊断、转移确定；组织器官移植的配型选择等等。
&nbsp;优化条件: ①Mg2+－降低浓度阻止非特异和不想要的PCR产物。增加浓度赢得更多的产量。EDTA螯合Mg2+，因而可以改变Mg2+的浓度。
②DNA模板浓度－为了减少Taq DNA聚合酶的产生错误的可能性，使用更高浓度的DNA。但是使用太多可能增加污染物的量，降低反应效率。
③聚合酶－与Pfx相比较，TaqDNA聚合酶具有更高的错配率（没有可以进行校正的3’到5’外切酶活性）。如果需要高保真度，可以使用Pfx。Taq酶倾向在3’末端增加非模板的A.为了提高效率，可以额外增加酶的量（由于Taq酶可能在重复的循环中损耗），然而这可能增加非特异的PCR产物.
④dNTP－可以使用高达1.5mM dNTP。dNTP螯合Mg。过高dNTP可能增加错配率。降低dNTP的浓度（10-50μM）可以减少错配率。大PCR片段比小的片段要求更多的dNTP。
⑤引物－可以使用高达3μM的引物。高引物模板比可能导致非特异扩增和引物二聚体的形成。小批量分装储存引物，以避免多次反复冻融。
⑥热循环－如果模板GC含量高，增加变性的时间。对于较大的PCR片段应该增加延伸的时间，但是这可能会对酶造成损害。如果模板DNA的量非常低，增加循环的次数，如果模板DNA的量大，减少循环次数。
⑦PCR缓冲液－更高浓度的缓冲液可以用来提高反应的效率。

19 &nbsp;基因芯片原理、基本类型、特点、主要应用。
答：基因芯片原理：反向固相分子杂交。大量寡核苷酸或cDNA作为探针固着于固相支持物上，借助核酸分子碱基互补配对特性，与标记的样本靶分子杂交，经激光共聚焦扫描仪检出杂交信号强度，通过计算机处理、分析而获得所需信息。
基本类型有：寡核苷酸芯片和cDNA芯片。
基因芯片特点有：①大规模。一次获得大量数据；②平行。一个阵列多样本分析；③小型。反应容积变小，反应动力学加快；④自动化。
应用：在基因组水平上研究基因表达、基因测序，检测基因突变和多态性；通过比较组织、细胞基因在正常和疾病状态下表达谱异常，可寻找疾病基因或疾病相关基因；在药物开发领域，利用基因芯片确定药物作用的靶向、作用的有效性、专一性以及药物作用的安全性。在微生物基因组水平上快速、并行分析有害微生物，加强监控流行病、传染病发生和传播的能力。基因表达分析可评估抗肿瘤治疗效果、病原体耐药性等。

20 &nbsp;基因诊断的特点以及在基因诊断中应用的主要分子生物学技术。
答：基因诊断优点：①能从分子水平上找到特异的致病基因，②有很高的灵敏度，③能获得稳定结果，④快速、早期诊断技术，⑤应用范围广、适用性强。
主要技术：核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术：①应用核酸分子杂交可进行基因的特异识别和分析，②PCR技术是基因诊断的基础技术，③DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术，④DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术。

21 &nbsp;基因治疗的基本策略、主要途径、应用的前提条件。
答：基因治疗基因策略：①基因替代：去除整个变异基因，用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更正。
②基因修正：将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。
③基因增强：将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。
④基因抑制或基因失活：通过导入外源基因去干扰、抑制或破坏有害或异常基因的表达。
&nbsp; 主要途径：①生殖细胞基因治疗：将外源正常基因转移到患者的生殖细胞（精子、卵子、受精卵）中，使其后代发育成正常个体并世代传递。
②体细胞基因治疗：只涉及体细胞的遗传改变，不影响下一代。 主要方法为转基因疗法，将正常的外源基因导入受体细胞，并随机整合到核DNA中进行表达，以补偿异常基因的功能的缺陷。
&nbsp; 应用条件：①该遗传病有一定发病率,且危害严重,现行各种疗法、手段无效或疗效不佳。
②已经在DNA水平上明确其发病机理。
③相关基因已被分离、克隆并了解清楚。
④导入基因只需低水平表达即可治愈疾病或改善病情。
⑤导入基因表达水平不需严格控制。
⑥该基因可在体外进行操作，且已在体外培养和动物实验等方面获得成功，可靠性好，安全性高。</p>