低温机械灌注对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响.pdf

论著低温机械灌注对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响罗德刘江周鹏程王飘李栩嘉林号民苏松【摘要】目的探讨低温机械灌注（HMP）对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响。方法雄性大鼠 30 只，随机分为对照组（Control 组），静态冷保存组（SCS 组）和 HMP 组，每组 10 只。记录 HMP 过程中流速、肾内阻力和灌注流出液 pH 值。收集每组肾脏组织，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测 CXC 趋化因子配体（CXCL）1、CXCL2、干扰素（IFN）-1、IFN-4、CC 趋化因子配体（CCL）2、CCL20、白细胞介素（IL）-17、IL-17C 和肿瘤坏死因子（TNF）-的信使 RNA（mRNA）表达水平，苏木素-伊红（HE）染色观察肾脏组织病理学改变。结果HMP 过程中的流速、肾内阻力保持稳定，灌注流出液 pH 值缓慢降低。RT-PCR 结果显示，与 Control 组比较，SCS 组和 HMP 组 CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17、IL-17C 和 TNF-的mRNA 相对表达量升高；与 SCS 组比较，HMP 组 CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17 和 TNF-的mRNA 相对表达量升高（均为 P0.05）。HE 染色结果显示，Control 组肾脏细胞形态正常，SCS 组出现明显的上皮坏死、胞质空泡化、刷状缘丢失、上皮脱落，与 SCS 组比较，HMP 组病理改变程度减轻。结论HMP 能激活肾脏炎症反应，抑制 HMP 过程中的炎症反应激活有望进一步提高移植物保存效果。【关键词】肾移植；低温机械灌注；静态冷保存；炎症因子；白细胞介素；干扰素；肿瘤坏死因子；趋化因子【中图分类号】R617，R364.5【文献标志码】A【文章编号】1674-7445（2023）06-0008-07DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023132基金项目：四川省科技厅联合创新项目（2022YFS0632-B4）作者单位：646000四川泸州，西南医科大学附属医院肝胆外科（罗德、王飘、李栩嘉、林号民、苏松），肾病内科（刘江）；西南医科大学附属中医医院肾病科（周鹏程）作者简介：罗德（ORCID：0000-0002-2295-1822），博士，研究方向为器官移植与免疫，Email：通信作者：苏松（ORCID：0000-0002-0894-1361），博士，研究方向为器官移植与免疫，Email：第 14 卷第 6 期器官移植Vol.14No.62023 年 11 月Organ TransplantationNov.2023Effect of hypothermic machine perfusion on expression levels of inflammatory cytokines in rat kidney Luo De*,Liu Jiang,Zhou Pengcheng,Wang Piao,Li Xujia,Lin Haomin,Su Song.*Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital ofSouthwest Medical University,Luzhou 646000,ChinaCorresponding author:Su Song,Email:【Abstract】ObjectiveToevaluatetheeffectofhypothermicmachineperfusion(HMP)ontheexpressionlevelsofinflammatorycytokinesinratkidney.MethodsThirtymaleratswererandomlydividedintothecontrol(Controlgroup),staticcoldstoragegroup(SCSgroup)andHMPgroup,with10ratsineachgroup.Thevelocity,intrarenalresistanceandpHvalueofperfusioneffluentwererecordedduringHMP.TheexpressionlevelsofCXCchemokineligand(CXCL)1,CXCL2,interferon(IFN)-1,IFN-4,CCchemokineligand(CCL)2,CCL20,interleukin(IL)-17,IL-17Candtumornecrosisfactor(TNF)-messengerRNA(mRNA)inrenaltissueswereevaluatedbyreversetranscriptionpolymerasechain reaction(RT-PCR).Pathological changes of the kidney were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining.ResultsDuringHMP,thevelocityandintrarenalresistanceremainedstable,andthepHvalueofperfusioneffluentwasdecreasedslowly.RT-PCRshowedthattherelativeexpressionlevelsofCXCL1,CXCL2,CCL2,CCL20,IL-17,IL-17CandTNF-mRNAintheSCSandHMPgroupswerehighercomparedwiththoseintheControlgroup.ComparedwiththeSCS group,the relative expression levels of CXCL1,CXCL2,CCL2,CCL20,IL-17 and TNF-mRNA were up-regulatedintheHMPgroup(allP0.05).HEstainingrevealedthatthemorphologyofrenalcellswasnormalintheControlgroup,whereasevidentepithelialnecrosis,cytoplasmicvacuolation,brushborderlossandepithelialsheddingwereobservedintheSCSgroup.ComparedwiththeSCSgroup,pathologicalchangesintheHMPgroupwerealleviated.Conclusions HMP may activate renal inflammation,and inhibiting the activation of inflammation during HMP isexpectedtofurtherimprovetheeffectofallograftpreservation.【Key words】Kidneytransplantation;Hypothermicmechanicalperfusion;Staticcoldstorage;Inflammatoryfactor;Interleukin;Interferon;Tumornecrosisfactor;Chemokine肾移植被视为终末期肾病的最佳治疗选择。然而，器官保存过程中的缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusioninjury，IRI）严重影响移植物功能，是移植成功的主要障碍1。因此，减轻器官保存中的IRI 并改善器官功能成为当前移植领域亟须解决的问题。静态冷保存（staticcoldstorage，SCS）是一种通过降低保存温度和减缓细胞代谢来实现器官保存的技术2-3。然而，大量研究证实，在 SCS 过程中，能量耗竭、氧化应激和免疫炎症激活等因素可能导致细胞结构和功能的受损，从而引发冷缺血损伤4-6。这种损伤在边缘供者中尤为显著，并且随着保存时间的延长，损 伤 程 度 会 进 一 步 加 重。低 温 机 械 灌 注（hypothermicmachineperfusion，HMP）通过持续供应氧气和能量物质，并及时清除代谢废物，能够减轻 IRI 并改善器官保存质量和效果，提高移植成功率并降低移植后并发症的风险7-8。在 IRI 中，炎症反应激活起着关键的作用，适度的炎症反应有助于组织修复和再生，但过度激活则会加剧组织损伤9-10。因此，控制炎症反应激活对于减轻 IRI 和保护器官功能至关重要。然而，目前关于肾脏 HMP 过程中炎症反应激活的研究报道非常有限。因此，本研究通过构建大鼠肾脏离体 SCS 和 HMP 模型，比较这两种器官保存方式对肾脏炎症因子水平的影响，为进一步研究器官保存提供参考。1材料与方法1.1 实验动物及主要试剂和仪器雄性 Fisher 大鼠 30 只，体质量 260300g，饲养于西南医科大学动物实验中心。组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液（histidine-tryptophan-ketoglutaratesolution，HTK 液）购于德国 Custodiol 公司，威斯康星大学保存液（UniversityofWisconsinsolution，UW 液）购于美国 BridgetoLife 公司，QuantiTect 逆转录试剂盒购于德国 Qiagen 公司，TaqManfastuniversalPCRmastermix 购于美国赛默飞公司，CXC 趋化因子配体（CXCchemokineligand，CXCL）1、CXCL2、干扰素（interferon，IFN）-1、IFN-4、CC 趋化因子配体（CCchemokineligand，CCL）2、CCL20、白细胞介素（interleukin，IL）-17、IL-17C、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-、-actin 引物购于第 6 期罗德等低温机械灌注对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响825 美国赛默飞公司，StepOne 逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）系统购于美国赛默飞公司，机械灌注系统购于德国 HugoSachsElektronik 公司。本实验通过西南医科大学附属医院伦理委员会审批（批号：20211119-067）。1.2 实验分组及处理方式将 30 只大鼠随机分为对照组（Control 组）、SCS 组和 HMP 组，每组 10 只，术前自由饮水。4.5%异氟醚深度麻醉后，打开胸腹腔并剪破心脏，经腹主动脉使用 4HTK 液冲洗肾脏，直至肾脏颜色变为均匀黄白色，剪破心脏到开始冲洗肾脏的时间大约为 5min。Control 组冲洗结束后获取肾脏置于10%多聚甲醛中固定，用于后续的病理组织学检查；SCS 组冲洗结束后获取肾脏置于 4HTK 液中保存12h；HMP 组冲洗结束后获取肾脏置于 4HTK 液中保存 12h，再使用 4UW 液以 80mmHg（1mmHg=0.133kPa）的恒定压力进行 2h 低温机械灌注，采用95%O2、5%CO2通过纤维膜氧合器对灌注液进行氧合。1.3 研究内容及方法1.3.1灌注参数机械灌注系统能实时记录流速及肾内阻力，灌注结束后收集灌注过程中的流速和阻力数据，并用大鼠肾脏质量进行标准化后进行后续分析。灌注过程中每 15min 收集静脉流出液，并使用酸碱度测定计测量其 pH 值。1.3.2逆转录聚合酶链反应实验取 20mg 肾脏组织于组织裂解器中使其变成组织匀浆，使用 RNAeasyMini 试剂盒提取总 RNA，分光光度计测定浓度，使用 QuantiTect 逆转录试剂盒进行逆转录获得 cDNA。随后使用 RT-PCR 系统检测 CXCL1、CXCL2、IFN-1、IFN-4、CCL2、CCL20、IL-17、IL-17C、TNF-的 CT 值。每个标本设 3 个复孔，用-actin 将每个基因平均 CT 值进行标化，并使用相对定量方法计算信使 RNA（messengerRNA，mRNA）的相对表达水平。1.3.3肾脏组织病理学检查多聚甲醛固定肾脏，经过不同浓度的乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后封片制成病理切片，进行病理组织学观察并对肾小管损伤进行评分。肾小管损伤采用改良的评分方法：在每张病理切片中，高倍镜下随机选取 10 个非重叠区域分别对肾小管扩张、空泡形成、刷状缘缺失、上皮坏死和上皮脱落五种组织形态学变化进行半定量评估。评分标准：结构正常 0 分；轻度改变为1 分（50%）。计算 10 个区域的平均分作为每张病理切片的肾小管损伤评分。1.4 统计学方法采用 SPSS26.0 软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料以均数标准差表示，两组独立样本间比较采用非配对 t 检验，同一组样本灌注前后比较采用配对 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 机械灌注过程中各参数变化流速在 HMP 过程中相对稳定，灌注结束时流速并未降低（2.70.4）mL/（ming）比（2.90.4）mL/（ming），P=0.5，图 1A。肾内阻力在HMP 过程中均相对稳定，灌注结束时与灌注开始时比 肾 内 阻 力 没 有 明 显 变 化 （2 2.2 1.6）mmHg/（ming）比（20.12.1）mmHg/（ming），P=0.3，图 1B。肾静脉灌注流出液 pH 值在 HMP 最初阶段下降，随后保持相对稳定，灌注结束时的pH 值低于灌注开始时（7.280.01 比 7.350.01，P=0.002，图 1C）。注：A 图为 HMP 过程中流速的变化；B 图为 HMP 过程中肾内阻力的变化；C 图为 HMP 过程中静脉流出液 pH 值的变化。图 1 HMP 过程中各参数变化Figure 1 Changes of parameters during HMP826器官移植第 14 卷2.2 各组肾脏炎症因子 mRNA 表达水平比较与 Control 组比较，SCS 组和 HMP 组 CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17、IL-17C、TNF-的 mRNA 相对表达量升高；与 SCS 组比较，HMP 组 CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17和TNF-的 mRNA 相对表达量升高（均为 P0.05，图 2）。2.3 各组肾脏组织病理学结果的比较肾脏组织切片 HE 染色结果显示，Control 组肾小管刷状缘完整，管腔无细胞碎片，细胞形态正常；SCS 组存在大量的细胞质广泛空泡化、刷状缘缺失、上皮坏死、上皮脱落、管腔阻塞，肾小管损伤严重；HMP 组仅有少量刷状缘丢失和上皮脱落，肾小管损伤轻微（图 3）。Control 组肾小管损伤评分为（0.340.11）分，低于 SCS 组的（6.200.59）分和 HMP 组的（4.100.76）分，而 HMP 组肾小管损伤评分低于 SCS 组（均为 P0.05）。注：与 Control 组比较，aP0.05；与 SCS 组比较，bP0.05。图 2 各组肾脏炎症因子 mRNA 表达水平Figure 2 mRNA expression levels of inflammatory factorsof kidneys in each group注：A 图为 Control 组；B 图为 SCS 组；C 图为 HMP 组。绿色箭头为上皮坏死，黑色箭头为刷状缘丢失，蓝色箭头为胞质空泡化，红色箭头为上皮脱落。图 3 各组肾脏组织病理学改变（HE，400）Figure 3 Histopathological changes of the kidney tissues in each group3讨论肾移植仍然是终末期肾病的最佳治疗选择，能够改善患者生活质量和延长寿命11-12。供者短缺是目前器官移植面临的巨大挑战13-15。边缘供者被迫用以补充供者池以改善供者短缺的窘境，这类供者对保存过程中的 IRI 更加敏感，术后移植物无功能发生率更高16-17。随着 Collins 液、UW 液、HTK 液等器官保存液相继开发和改进，SCS 成为了目前常用的器官保存方式，被多数器官移植中心广泛使用18-19。SCS 主要通过降低温度来抑制细胞代谢，然而长时间SCS 可能会导致细胞活力丧失甚至坏死20-21。冷保存时间越长，器官遭受的损伤越严重，特别是对于边缘供器官，这大大降低了 SCS 的效果22-24。近年来，研究人员开始更加关注 HMP，它不仅可以保存器官，改善器官功能，还可用于评估器官功能25-28。本研究结果表明，HMP 虽然激活了肾脏的炎症反应，但减轻了肾脏冷保存损伤。靶向调控 HMP 过程中的炎症反应为进一步改善器官功能提供了新的思路。肾脏机械灌注过程中的血流动力学变化是一个重要的功能参数，可用于评估灌注效果和肾脏损伤程度6。由于体外灌注过程中灌注压力恒定，因此流速与肾内阻力成反比。本研究发现，灌注过程中肾内阻力相对稳定，无明显变化。Blum 等29对猪肾脏进行8h 的 HMP，也发现灌注过程中肾内阻力保持基本稳定。IRI 过程中存在多种炎症因子的释放和激活，如第 6 期罗德等低温机械灌注对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响827 细胞因子 TNF-、IFN-1、IFN-4、IL-17、IL-17C，趋化因子 CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL2030。这些炎症因子在 IRI 中发挥着重要的作用，调控这些炎症因子有助于减轻 IRI，改善器官保存和移植效果。对机械灌注过程中炎症因子的研究，有助于深入理解机械灌注对器官的影响，并为开发相关的治疗策略提供基础。目前，对于机械灌注过程中移植物炎症细胞因子的变化，大部分研究集中在常温机械灌注（normothermicmachineperfusion，NMP）31，对于HMP 过程中炎症因子的变化研究非常有限。一项包括 293 例肝移植受者的随机临床多中心试验数据显示，相比于 SCS，NMP 能显著减轻肝小叶炎症，减轻 IRI32。Beetz 等33研究发现，相比于 SCS，6h的 NMP 明显提高了猪肝 IL-1、IL-1、IL-2、IL-6和 IL-18 的表达水平。然而，Fontes 等34研究表明，与 SCS 相比，机械灌注明显降低猪肝 IFN-、IFN-、TNF-、IL-1、IL-4 和 IL-12 的水平。Jager 等35分别对猪和人的肾脏进行 4h 和6h 的 NMP，每小时采集灌注液样本以评估促炎因子变化水平，发现 IL-6、IL-8 和 TNF 在 NMP 期间显著增加。Yang 等36使用夹闭兔子肾脏 25min 模拟热缺血损伤，SCS 组松开夹子再灌注 29h 后在 4 高渗柠檬酸腺嘌呤溶液-溶液（hypertoniccitrateadeninesolution-，HCA-溶液）中进行 6h 的 SCS，NMP 组松开夹子恢复血流 1h，然后再进行 HMP 保存 6h，结果发现与 SCS 组相比，HMP 组核因子（nuclearfactor，NF）-B 和 TNF-的表达明显降低。然而本研究发现与 SCS 组相比，HMP 组肾脏多种促炎因子mRNA 表达水平显著升高，且 HMP 能减轻冷保存损伤，研究结果的差异可能与两个实验方案中热缺血时间、保存液种类以及保存时间不同有关。赵德芳等37比较了 SCS 和 HMP 对犬肝脏炎症因子水平的影响，发现移植后 HMP 组肝脏 IL-1、TNF-、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白（macrophageinflammatoryprotein，MIP）-1、MIP-1、CCL20 的 mRNA 表达水平明显低于 SCS 组，而在移植前的肝脏中只有 TNF-、MIP-1、MIP-1、CCL20 的 mRNA 表达水平差异有统计学意义。本研究采用大鼠肾脏作为实验对象，实验设计也有所不同，获取的肾脏置于 4 的 HTK 液中保存 12h，而赵德芳等37对移植前的肝脏采用生理盐水保存约3h。此外，本研究中的 HMP 组肾脏在 SCS12h后，继续进行 2h 的 HMP，而 SCS 组仅接受了 12h的 SCS，因此 HMP 组肾脏的冷缺血时间更长。这可能是导致 HMP 组肾脏炎症因子表达水平明显升高的原因。相较于 SCS，虽然 HMP 升高了肾脏炎症因子的 mRNA 表达水平，但改善了肾脏病理损伤，这可能与 HMP 降低移植物代谢率、提供氧气、清除代谢产物、维护细胞膜稳定性和抗氧化等多种机制有关。综上所述，肾脏移植物在 HMP 期间的炎症反应被激活，在 HMP 过程中降低移植肾的免疫炎症活性有望进一步提高机械灌注效果，改善移植物存活率。参考文献：MIC-CARNERO M,ZAOUALI MA,ROJANO-ALFONSO C,et al.A potential route to reduceischemia/reperfusion injury in organ 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