定量评价南方根结线虫趋性方法的建立及应用.pdf
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1、研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0055定量评价南方根结线虫趋性方法的建立及应用魏钰洋,谢佳*,王帅,丁晓帆,杨紫薇,白永霞,姚友植,孙然锋*(海南大学植物保护学院,热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室,海口570228)摘 要:为了能够定量评价南方根结线虫 Meloidogyne incognita2 龄幼虫的趋化性,本研究以PluronicF-127 胶体为载体,建立了一种能够借助体式显微镜相机及 ImageJ 灰度值统计法对根结线虫移动轨迹进行量化检测,从而判断根结线虫 2 龄幼虫趋性的测试方法,并用 10 种已报道的具有趋性活性的化合物
2、验证了方法的可靠性。另外,采用该方法测定了 40 种化合物对南方根结线虫的趋性活性。研究结果表明,10g/mL 质量浓度下,22 种测试化合物具有吸引活性、11 种化合物具有驱避活性,其中对茴香胺和间苯三酚分别具有较强的吸引和驱避线虫活性。进一步研究表明,对茴香胺对南方根结线虫 2 龄幼虫具有低浓度吸引和高浓度驱避的趋性活性,而间苯三酚对该幼虫的驱避活性随浓度增高而增强。该研究为快速定量评价化合物对南方根结线虫 2 龄幼虫的趋性及发现高活性根结线虫驱避剂提供了一种可靠的方法。关键词:定量评价;根结线虫;趋性活性;引诱剂;驱避剂中图分类号:S482.51文献标志码:AEstablishment
3、and application of quantitative evaluation method for thechemotaxis of Meloidogyne incognitaWEIYuyang,XIEJia*,WANGShuai,DINGXiaofan,YANGZiwei,BAIYongxia,YAOYouzhi,SUNRanfeng*(Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Agriculture and Forestry Biological Disasters Ministry ofEducation
4、,School of Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China)Abstract:Toquantitativelyevaluatethechemotaxisofthesecond-stagejuveniles(J2s)ofMeloidogyneincongnita,anexperimentalmethodusingstereomicroscopecameraandImageJgrayscalestatisticsmethodtodetectthechemotaxisofJ2sbyanalyzingthemovementtraj
5、ectoryoftheroot-knotnematodeinPluronicF-127gelwasestablished,andverifiedthereliabilityofthemethodwith10reportedcompoundstoinducechemotaxis.Inaddition,themethodwasusedtodeterminethechemotaxisof40compoundsagainstM.incongnita.Theresultsshowedthat22compoundshadattractiveactivityand11收稿日期:2023-03-28;录用日期
6、:2023-05-30;网络首发日期:2023-06-25.Received:March28,2023;Accepted:May30,2023;Published online:June25,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0055http:/ KYQD(ZR)-21041.Funding:SupportedbytheNaturalScienceFoundationofHainanProvince(No.321QN178,321CXTD436,321QN177)andtheScientificResearchStar
7、t-upFundProjectofHainanUniversityNo.KYQD(ZR)-21041.第一作者(Firstauthor):魏钰洋,.*通信作者(Correspondingauthors):谢佳,;孙然锋,.Theauthorsdeclarethattheyhavenocompetinginterests.农药学学报2023,25(5):1068-1075http:/Chinese Journal of Pesticide ScienceE-mail:compoundshadrepellentactivityattheconcentrationof10g/mL,withp-ani
8、sidineandphloroglucinolbeingthemostattractiveandrepellenttonematodes,respectively.Furtherstudiesshowedthatp-anisidineexhibitedattractionactivityatlowconcentrationsandrepellentactivityagainstJ2sofM.incongnitaathighconcentrations,whiletherepellentactivityofphloroglucinolincreasedwithhigherconcentratio
9、ns.ThisstudyprovidesareliablemethodforrapidandquantitativeevaluationofthechemotaxisofcompoundsagainstM.incongnitaandforthediscoveryofhighlyactiveroot-knotnematoderepellents.Keywords:quantitativeevaluation;root-knotnematode;chemotaxisactivity;attractants;repellents根结线虫(Meloidogynespp.)属于植物根系内寄生线虫,可为害
10、大多数开花植物1,主要靠口针刺伤寄主根部进行寄生,并诱导取食位点产生巨细胞影响植物健康。根结线虫感染后,作物可减产 40%80%,严重时甚至造成连作耕地内大片农作物绝收2,其种群在世界各地均有广泛分布,每年造成农作物损失超过 1000 亿美元3。我国作为农业大国,危害生产的主要根结线虫种类为南方根结线虫 Meloidogyne incongnita4。开发绿色防控手段以减轻根结线虫危害造成的经济损失成为当前十分重要的课题。根结线虫从卵发育成 2 龄幼虫后,利用自身有限的能量移动至寄主植物根部并完成侵染是其生活史中最重要的一环,这一过程离不开线虫体内化学物质感受器对线虫移动的指向作用。头感器作为
11、线虫体内主要的化学感受器5,能够指示线虫分辨植物根系分泌物。研究表明,番茄碱、玉米素、柠檬烯等植物的特定代谢产物能够有效引导线虫定向运动,并且具有浓度依赖效应6-7,这表明线虫头感器受到特定分泌物刺激后,会沿低浓度区域向高浓度区域移动,最终到达植物根部进行侵染。而土壤环境中除了含有吸引线虫的物质外,也存在能够对线虫造成负面影响、抑制其生命活动或具有驱避作用的物质,这些物质一部分来自于土壤,例如无机盐硝酸钾8,还有一部分来自土壤中的微生物,例如苯并噻唑、2-辛酮9-10等,也有植物被病害侵染刺激后分泌的自我防御性的活性物质,如百里酚7及二氢辣椒碱11等。这些物质能够驱离根结线虫 2 龄幼虫,表明
12、根结线虫化学感受器能够警示其逃逸有害物质。利用其这一特性,如果提前在作物根部附近施用具有驱避活性的物质,则能够达到预防侵染、减轻病害的目的。因此,通过开发影响根结线虫趋性的特异性化合物而应用于作物根部保护是一个新的根结线虫防控策略。为了能够有效地测试根结线虫对物质的趋性,已有许多研究方法被应用并证实。例如琼脂糖法12、沙土法13、微流控芯片法14及 PluronicF-127(以下简称“PF 胶”)15等。其中,PF 胶是一类新型的高分子非离子表面活性剂,为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物15。质量浓度为 23%的 PF胶具有在 4 为液体、在室温凝结为固体凝胶的可逆特性,因易于操作且根结线虫能够
13、在其中进行三维移动并被实时观察而在线虫行为研究领域得到广泛的应用。许多学者利用这一材料完成了根结线虫对植物寄主分泌物趋性的研究,发现由番茄等寄主中分离出的水杨酸甲酯、鼠李糖半乳糖醛酸-I 及根部呼吸作用产生的 CO2等多种物质对线虫具有普遍的吸引活性11,16。PF 胶也被应用在对线虫引诱剂的合成化合物库筛选中,如尸胺和腐胺被证实同样能够引诱根结线虫17。在线虫对环境变化响应方面,研究者利用 PF 胶测试得出大豆孢囊线虫 2 龄幼虫在 pH 值 4.985.46 之间能大量积聚,且氯离子浓度在 171256mmol/L 区间内对大豆孢囊线虫 2 龄幼虫的吸引效果最佳18。然而,目前 PF 胶对
14、根结线虫的行为学研究主要集中在吸引活性物质定性筛选方面,利用 PF 胶对根结线虫进行驱避活性定量检测的研究则仅有利用计数方法的少数报道11。由于计数方法繁琐耗时,不利于根结线虫趋性物质活性的快速大量评价,因此建立一种快速定量评价南方根结线虫趋性的方法十分必要。在本研究中,基于 PF 胶设计了一种可检测根结线虫对物质趋性指数(含正负趋性)的模型,并建立了借助体式显微镜相机及 ImageJ灰度值统计法对根结线虫的运动轨迹进行量化计算得到趋性指数从而判断趋性的新方法。采用已报道的对根结线虫趋性有明显作用的化合物进行模型和方法的验证,并利用该方法对 40 种化合物No.5魏钰洋等:定量评价南方根结线虫
15、趋性方法的建立及应用1069进行了趋性测试。研究结果可为快速寻找吸引和驱避根结线虫化合物提供思路,也可为田间根结线虫生态防控、减少杀线虫剂的使用和减缓抗药性的产生奠定理论基础。1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1供试线虫南方根结线虫 Meloidogyneincongnita2 龄幼虫,采自本课题组日光温室内发病的番茄根系,采用 Giannakou 等19的方法,洗去病根表面的沙土后挑取新鲜的卵囊,用质量分数为 0.5%的次氯酸钠溶液进行表面消毒 1min,用无菌水冲洗 3 次,在 50mm 培养皿内于黑暗条件下、25 左右孵化,每天更换一次蒸馏水。以第 4 天起孵化 24h 产生的 2
16、 龄幼虫为供试线虫,以保证线虫的活力。1.1.2化合物及试剂10 种验证化合物:硝酸钾(1000g/mL)、百里酚(50g/mL)、苯并噻唑(50g/mL)、2-辛酮(50g/mL)、二苯并呋喃(10g/mL)、3-甲氧基苯甲酸(10g/mL)、1,5-戊二胺(10g/mL)、1,4-丁二胺(10g/mL)、十三烷(10g/mL)和水杨酸甲酯(1g/mL),均购于北京伊诺凯科技有限公司。40 种待测试化合物:对茴香胺、4-羟基-5,6-二甲基吡喃-2-酮、混旋樟脑磺酸、四水合酒石酸钾钠、对正丁基苯胺、苯甲酸、香芹酮、苯甲酸乙酯、2-氨基苯并咪唑、三苯基膦、1-氯-4-硝基苯、对羟基苯甲醛、4-
17、羟基-6-甲基-2-吡喃酮、苯甲腈、乙嘧酚、2-溴吡啶、吡啶、3,5-二氯-4-甲基苯胺、2,6-二氯苯硼酸、1-溴辛烷、N-乙基苄胺、2,4-二氯苯乙酮、桂皮醛、1-辛醛、-紫罗兰酮、2,6-二氯苯胺、2,6-二氯-4-氨基苯酚、水杨羟肟酸、对羟基苯丙酸甲酯、1-四氢萘酮、邻氨基苯酚、碳酸丙烯酯、2-甲基间苯二酚、-香茅醇、2,3-二甲氧基苯酚、噻吩-2-羧酸甲酯、4-乙基苯胺、香叶醇、亚磷酸二乙酯和间苯三酚,测试质量浓度均为 10g/mL,均购于北京伊诺凯科技有限公司;PF 胶,购于 Sigma-Aldrich;95%乙醇等溶剂为分析纯,购于西陇科学股份有限公司。1.1.3主要仪器设备NI
18、KONSMZ745T 体式显微镜及配套数字相机(尼康光学仪器有限公司);63mmWR63HWLED 环形灯源(苏州德乐达电子科技有限公司)。1.2 PF 胶胶体制备根据 Wang 等15的方法制备:在 4 条件下,将 23gPF 胶胶体粉末溶于 80mL 蒸馏水中并搅拌溶解 24h,得到质量浓度为 23%的 PF 胶胶体。将溶有待测化合物的药液加入蒸馏水中,同法用其搅拌溶解 PF 胶胶体粉末,制得对应浓度的含有待测化合物的 PF 胶胶体;溶剂对照则相应地加入与药液等量的溶剂。制得的胶体均贮存于 4冰箱中备用。1.3 模型设计、测试方法建立及根结线虫趋性测试如图 1 所示,在直径 60mm 玻璃
19、培养皿底内放置一个内部长 40mm、宽 20mm、高 5mm 的硅胶模具,在模具中央放置硅胶隔垫将区域隔为面积相等的两个正方形区域。左侧加入 1mL 含有待测化合物的 PF 胶胶体作为处理侧(图 1A),右侧加入 1mL 含有 95%乙醇等对照溶剂的 PF 胶胶体作为溶剂侧(图 1B),室温下放置。待其凝固后,撤去中央的硅胶隔垫,并刮去交界处左、右各 4mm 共 8mm 宽的胶体,在留出的空白区域内加入 0.5mL 空白 PF 胶胶体作为缓冲区域。待全部胶体凝固后,将 10L 约 150条南方根结线虫 2 龄幼虫注入胶体缓冲区域的中心,保湿并置于 25 黑暗环境中 8h,待根结线虫在胶体内运动
20、形成轨迹后对胶体平面处理侧和溶剂侧分别在固定倍数及参数下使用 NIKONSMZ745T体式显微镜及配套数字相机拍摄图片,并用图像处理软件 ImageJ 处理为黑白 8 位图像,对轨迹对应的白色像素数进行处理和计算后可得出线虫轨迹在整张图片像素数中所占的百分比,按公式(1)ABA 为待测化合物侧,B 为溶剂侧,中央白色部分为空白缓冲区,红色圆圈为线虫注射区。ArepresentsthetestcompoundsideandBrepresentsthesolventside,whitepartrepresentsblankbufferzone,redcirclerepresentsnematode
21、injectionzone.图 1 模型设计示意图Fig.1 Model design diagram1070农药学学报Vol.25计算趋性指数(chemotaxisindex,CI)。CI=2AA+B100%(1)其中,A 为处理侧所占百分比,B 为溶剂侧所占百分比。规定左、右百分比各占 50%的空白对照的趋性指数为 1.00;当趋性指数在 1.000.05区间时,判定该处理对线虫趋性没有明显影响;高于 1.05 时判定具有吸引活性;低于 0.95 时具有驱避活性,即处理区域轨迹越稀疏、溶剂区域轨迹越密集,证明该化合物的驱避效果越好,趋性指数越低;反之吸引效果越好,趋性指数越高。1.4 测试
22、方法的验证及新化合物趋性测试和浓度梯度测试对已报道的 10 个化合物进行检测,测试浓度参考文献报道的测试浓度或取较低浓度,以检验测试方法的可靠性。验证可靠后,选取 40 种未知趋性的化合物进行测试,并选择效果较为明显的两个化合物对茴香胺及间苯三酚进行 5、10、25、50、100 和 200g/mL 共 6 个质量浓度梯度测试。每个化合物均设 5 次平行,3 次重复试验。2 结果与分析 2.1 模型及测试方法可靠性验证按照图 1 的设计,本研究顺利完成了模型设计及测试方法建立。同时,以 PF 胶为载体对 10种已报道在琼脂平板、沙土或 PF 胶等介质中具有趋性活性的化合物进行重复验证。验证结果
23、(表 1)显示:本方法测得的趋性结果与文献报道全部一致,从而证明了模型设计和统计方法的合理性。根结线虫对于具有吸引活性的化合物如水杨酸甲酯及十三烷等响应较为灵敏,在 1g/mL 或10g/mL 下均能检测出较为明显的吸引活性,其中十三烷在 10g/mL 测试质量浓度下趋性指数达到 1.530.07(图 2);对于具有驱避活性的化合物,则普遍需要 50g/mL 或更高质量浓度才能较好地使根结线虫有效避开。在驱避活性测试中,可明显观察到根结线虫在处理侧的轨迹分布较为稀疏,证明驱避物质使线虫放弃进入处理侧转而进入溶剂侧活动(图 3)。2.2 40 种化合物对根结线虫的趋性活性根结线虫对 40 种未测
24、定化合物的趋性指数的测定结果如表 2 所示,其中有 22 种具有吸引活性,11 种具有驱避活性。在测试的 40 种供试化合物中,对茴香胺表现出的吸引活性最强,趋性指数为 1.530.09(图 4),而间苯三酚则表现出最强的驱避活性,趋性指数为 0.690.06(图 5)。表 1 验证化合物对南方根结线虫的趋性活性Table 1 Validation of chemotaxis activity of compoundsagainst M.incognita化合物Compound文献报道趋性Reportedchemotaxis测试质量浓度Testconcentration/(g/mL)趋性指数C
25、hemotaxisindex,CI硝酸钾Potassiumnitrate驱避8Repellent10000.540.06百里酚Thymol驱避7Repellent500.580.04苯并噻唑Benzothiazole驱避9Repellent500.620.042-辛酮2-Octanone驱避10Repellent500.770.03二苯并呋喃Dibenzofuran吸引9Attractant101.180.033-甲氧基苯甲酸m-Anisicacid吸引13Attractant101.260.03水杨酸甲酯Methylsalicylate吸引11Attractant11.310.051,5-戊
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