丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析.pdf

基金项目国家自然科学基金（82273196）通信作者（Corresponding author），Email：zhaowei_.丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析何继凯1，瞿文豪2，贾佳琦1，杨小兵3，王彬3，贾立周2，黄衍强1，赵薇3*1右江民族医学院研究生院，广西百色533000；2巴彦淖尔市医院中心实验室，内蒙古巴彦淖尔015000；3南京医科大学附属南京医院病理科，江苏南京210006摘要 目的：探究丁酰胆碱酯酶（bcylcholinesterase，BCHE）在胃癌（gastric cancer，GC）中的预后价值，验证和分析BCHE对胃癌细胞生物学功能的影响。方法：采用Lasso回归法筛选预后基因，并利用卡方检验验证BCHE表达水平与临床病理参数之间的关系；利用TIMER2.0数据库和CIBERSORT算法研究BCHE和免疫细胞浸润之间的相关性，WGCNA算法和DAVIDBioinformatics Resources数据库进行富集分析；qRTPCR检测正常人胃上皮细胞系（GES1）及人胃癌细胞系（HGC27和MKN1）中BCHE的表达情况；在HGC27和MKN1细胞系中瞬时转染小干扰RNA敲减BCHE后，利用CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力，黏附实验检测细胞黏附能力，Transwell和划痕实验检测细胞迁移、侵袭能力等功能变化情况。结果：利用Lasso回归分析筛选出15个与GC患者预后相关的基因，其中BCHE具有最佳的预测价值；进一步分析表明BCHE在胃癌组织中的表达水平显著高于其在癌旁组织中的表达水平，且BCHE在肿瘤细胞中的表达与免疫细胞浸润密切相关。富集分析结果显示BCHE高表达与细胞增殖、细胞迁移和细胞黏附等有关。体外实验进一步证实降低BCHE的表达显著抑制胃癌细胞系的恶性生物学功能。结论：BCHE可作为GC的预后生物标志物，且可促进肿瘤内免疫细胞浸润；此外，降低BCHE表达可抑制其介导的恶性生物学功能。关键词 BCHE；胃癌；预后；肿瘤浸润免疫细胞中图分类号 R735.2文献标志码 A文章编号 10074368（2023）10135610doi：10.7655/NYDXBNS20231004The prognostic value and biological functions of butyrylcholinesterase in gastric cancerHE Jikai1，QU Wenhao2，JIA Jiaqi1，YANG Xiaobing3，WANG Bin3，JIA Lizhou2，HUANG Yanqiang1，ZHAO Wei3*1Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000；2Central Laboratory，BayannurHospital，Bayannur 015000；3Department of Pathology，the Affiliated Nanjing Hospital of Nanjing MedicalUniversity，Nanjing 210006，ChinaAbstract Objective：This study aims to explore the prognostic value of butyrylcholinesterase（BCHE）in gastric cancer（GC）andanalyze its impact on the biological functions of gastric cancer cells.Methods：Firstly，Lasso regression method was used to screenprognostic genes，and the relationships between BCHE expression levels and clinical pathological parameters were verified usingchisquare test.In addition，TIMER 2.0 database and CIBERSORT algorithm were utilized to investigate the correlation betweenBCHE and immune cell infiltration，and enrichment analysis was performed using WGCNA algorithm and DAVID BioinformaticsResources database.Finally，the expression levels of BCHE in normal gastric epithelial cell line（GES1）and gastric cancer cell lines（HGC27 and MKN1）were detected by realtime qPCR.Following transient transfection of small interfering RNA was conducted toknockdown the expression of BCHE in HGC27 and MKN1 cell lines.Cell proliferation was detected by CCK8 and colony formationassay.Cell adhesion ability was detected by adhesion assay.Cell migration and invasion were detected by transwell and scratch assay.Results：Fifteen genes related to the prognosis of GC patients were screened out using Lasso regression analysis.Among them，BCHEhas the best predictive value.Further analysis indicated that the expression level of BCHE in GC tissues was higher than those in theadjacent tissues or healthy controls，while the expression of BCHE in tumor cells was closely related to immune cell infiltration related基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第10期2023年10月1356molecules.Enrichment analysis showed that the high expression of BCHE was related to cell proliferation，migration and adhesion.Theresults of in vitro experiments further confirmed that reducing the expression of BCHE significantly inhibited the malignant biologicalfunction of gastric cancer cell line.Conclusion：BCHE serve as a prognostic biomarker for GC and can promote immune cellinfiltration in tumors.In addition，reducing the expression of BCHE can inhibit its mediated malignant biological function.Key words BCHE；gastric cancer；prognosis；tumorinfiltrating immune cellJ Nanjing Med Univ，2023，43（10）：13561365GC（gastric cancer，GC）是全球第5大癌症，死亡率居全球第4位1-2。目前，GC的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但术后局部复发或远处转移的发生率超过40%3。此外，放疗和化疗后会出现明显的不良反应，导致晚期GC患者的5年生存率仅约20%4-5。因此，寻找GC新的治疗和预后靶点以提高患者的生存率，已成为一项迫切的公共卫生问题。为筛选出与GC预后相关的基因，本研究采用多种分析方法发现，在GC中丁酰胆碱酯酶（bcylcholinesterase，BCHE）具有良好的预后价值。BCHE是一种由肝脏合成并分泌到血液中的血浆酶，主要表达于外泌体和内质网6，其半衰期约为 12 d，参考值为5 90013 200 U/L7-8。研究表明，口腔癌和乳腺癌患者血清中BCHE 的表达水平明显升高9-10。然而，BCHE 基因在GC中的表达水平、调控机制，以及与临床治疗和预后的相关性仍不清楚。1材料和方法1.1材料本研究的GC患者临床病理信息和基因转录组数据都来源于UCSC Xena数据库的肿瘤基因组图谱（TCGA）11。人GC细胞系HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞系GES1（武汉普诺赛生命科技有限公司）。qRTPCR试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipo6000、CCK8试剂（上海碧云天生物公司）；基质凝胶（厦门模基生物科技有限公司）。1.2方法1.2.1生信数据处理首先使用Lasso回归筛选预后基因12，并采用KaplanMeier生存曲线和单因素、多因素Cox回归分析BCHE基因表达在GC中的预后价值；其次采用卡方检验验证BCHE mRNA与临床病理参数之间的关系，使用TIMER2.0数据库（https：/cistrome.shinyapps.io/timer/）13和 CIBERSORT 算法研究 BCHE 和免疫细胞浸润之间相关性，此外，利用 WGCNA 算法和DAVID Bioinformatics Resources数据库（https：/david.ncifcrf.gov/）14对BCHE基因进行Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析。1.2.2qRTPCR使用细胞 RNA 提取试剂盒提取人 GC 细胞HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞GES1的RNA，再用逆转录试剂将RNA逆转录成cDNA，以GAPDH作为内参对BCHE进行qRTPCR扩增。BCHE R：5TGTTGCAGAGAATCGGAAATCAA3，F：5CCCAATAAGCATGCAGAGCA3。GAPDH R：5GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，F：5GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3。采用2-Ct计算相对表达量。1.2.3细胞转染利用siRNA靶向敲减BCHE基因。将细胞分为对照组、空载组（siNC）和实验组（siBCHE），收集处理后的HGC27和MKN1细胞，并配制成2105个/mL的细胞悬液，铺入6孔板中，每孔2 mL。培养24 h后，每孔滴加7.5 L Lipo6000和7.5 L siRNA，在培养箱中培养48 h后进行下一步实验。1.2.4CCK8和克隆形成实验CCK8 实验：收集处理后的 HGC27 和 MKN1细胞，并配制成2104个/mL的细胞悬液，铺入96孔板中，每孔100 L，分别在24、48、72、96 h后加入10 L CCK8试剂，在37 下孵育2 h后检测450 nm的吸光度值。克隆形成实验：收集处理后的HGC27和MKN1细胞，并配制成1103个/mL的细胞悬液，铺入6孔板中，每孔1 mL，观察到克隆体的外观后使用甲醛固定细胞，再用1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。1.2.5细胞黏附实验96孔板每孔加入100 L的1 4基质凝胶，凝胶第43卷第10期2023年10月何继凯，瞿文豪，贾佳琦，等.丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1356-13651357南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月ABCDEF182421021226418330521P=0.002HR=1.89，95CI%：1.252.880306090120低高疾病特异性生存率（%）低表达组（n=203）高表达组（n=204）时间（月）151050癌（n=407）P0.001癌旁（n=143）/期（n=159）/期（n=182）P=0.020BCHE mRNA表达水平11931721116120224111220306090120低高低表达组（n=120）高表达组（n=121）P=0.004HR=2.48，95CI%：1.314.69时间（月）1953152119442102121660306090120低高低表达组（n=203）高表达组（n=204）1007550250总生存率（%）时间（月）P 0.001HR=1.77，95CI%：1.282.401944910212264194255210306090120低高P=0.001HR=1.77，95CI%：1.252.51低表达组（n=203）高表达组（n=204）时间（月）log2221 201 184 152 131 95 63 42 26 21 15 8 3 3 00.750.650.550.45-5.5-5.0-4.5-4.0-3.5-3.0部分似然偏差A：Lasso回归模型筛选GC预后相关基因；B：生存曲线分析BCHE表达与GC患者的总生存期情况；C：生存曲线分析BCHE表达与GC患者疾病无进展生存期情况；D：生存曲线分析BCHE表达与GC患者疾病特异性生存期情况；E：生存曲线分析BCHE表达与GC患者无病生存期情况；F：BCHE mRNA在癌/癌旁组织和早期（/）/晚期（/）GC患者癌组织中的表达水平。图1BCHE mRNA在GC中的表达水平及相关生存分析Figure 1The expression of BCHE mRNA and related survival analysis in GC凝固后，收集处理过的HGC27和MKN1细胞，并配制成1105个/mL的细胞悬液，铺入96孔板中，每孔100 L，随后置于细胞培养箱中孵育2、4和8 h，PBS洗涤3次后，更换新的培养基后进行CCK8检测。1.2.6迁移和侵袭实验迁移实验：收集处理后的 HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成2105个/mL的细胞悬液，铺入6孔板中，每孔2 mL，24 h后使用灭菌的200 L枪头垂直于6孔板底部横线划线，更换无血清培养基，分别在0、12、24 h后使用荧光倒置显微镜拍照。侵袭实验：收集处理后的HGC27和MKN1细胞，并配制成1106个/mL 的无血清细胞悬液，将细胞加入铺有1 8基质凝胶的Transwell上层小室中，每孔100 L。小室的底部加入500 L 20的血清培养基。培养48 h后，使用甲醛固定细胞，再用0.1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。1.3统计学方法所有统计分析都使用 R 软件（4.1.2 版本）和GraphPad Prism 8进行，符合正态分布的数据资料以均数标准差（x s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验。根据中位数将BCHE mRNA在GC组织中的表达水平分为高表达组和低表达组15-18。生存分析采用 KaplanMeier 法并进行 logrank 检验。使用R包“forestplot”进行单因素和多因素Cox回归分析，并将单因素分析中差异具有统计学意义（P 0.05）的变量纳入多因素分析。BCHE表达高低与临床病理参数的关系采用卡方检验。P 0.05为差异有统计学意义，每组实验重复3次。2结果2.1BCHE与GC患者预后及临床病理参数的关联性分析首先通过Lasso回归分析筛选出15个与GC患者 总 生 存 期（overall survival，OS）有 关 的 基 因：BCHE、GPX3、ADAMTS18、ASPA、CD36、SERPINE1、CYP19A1、LRAT、CGB5、ANO3、SOX14、CYMP、CFHR4、F13B和OTX2（图1A）；其次，根据生存曲线分析筛选出影响预后差异最显著的基因BCHE（P 0.001，图1B），且发现BCHE mRNA高表达的GC患者无进展生存期（P=0.001）、疾病特异性生存期（P=0.002）和无病生存期（P=0.004）更短（图1CE）。进一步分析发现，BCHE mRNA在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织（P 0.001），同时 BCHEmRNA在晚期GC（/期）患者中的表达水平高于早期 GC（/期）患者（P=0.020，图 1F）。根据BCHE mRNA在GC组织中表达水平的中位数将患者分为高表达组和低表达组，分析BCHE mRNA的表达与GC患者临床病理学参数之间的关系。结果表明，BCHE mRNA 的高表达与 T 分期（P=0.029）、1007550250无病生存率（%）1007550250无进展生存率（%）10075502501358表1BCHE mRNA与GC患者临床病理参数的关系Table 1The relationship of BCHE mRNA with clinical features病理参数年龄（岁，x s）性别 n（%）女男T分期 n（%）T1/2T3/4N分期 n（%）N0/1N2/3M分期 n（%）M0M1TNM分期 n（%）/期/期肿瘤类型 n（%）高/中分化低分化TMB n（%）高低MSI n（%）高低BCHE高表达组（n=204）64.69 10.62068（33.33）136（66.67）041（21.69）148（78.31）120（62.50）072（37.50）180（91.84）016（8.16）070（40.70）102（59.30）059（29.65）140（70.35）086（42.79）115（57.21）081（40.10）121（59.90）BCHE低表达组（n=203）66.42 10.61077（37.93）126（62.07）059（32.24）124（67.76）109（55.33）088（44.67）183（95.31）09（4.69）089（52.66）080（47.34）095（47.74）104（52.26）116（57.14）087（42.86）122（60.10）081（39.90）P值0.1040.3870.0290.1820.2350.035 0.001 0.001 0.001总计（n=407）65.55 10.64145（35.63）262（64.37）100（26.88）272（73.12）229（58.87）160（41.13）363（93.56）25（6.44）159（46.63）182（53.37）154（38.69）244（61.31）202（50.00）202（50.00）203（50.12）202（49.88）TNM分期（P=0.035）、肿瘤类型（P 0.001）、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）（P 0.001）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）（P 0.001）等临床病理参数相关（表1）。此外，单因素分析结果显示BCHE mRNA的表达水平（P 0.001）、年龄（P=0.010）、T分期（P=0.002）、M分期（P=0.002）、N分期（P=0.002）、TNM分期（P 0.001）和肿瘤类型（P=0.030）与GC患者预后有关。将单因素分析中有统计学意义的临床因素和BCHE表达水平因素一并纳入多因素分析，结果表明BCHE mRNA的表达水平（P=0.006）、年龄（P=0.025）和M分期（P=0.019）均是GC患者的独立预后因素（表2）。2.2BCHE表达和免疫细胞浸润的相关性分析首先，使用CIBERSORT算法研究BCHE mRNA与免疫细胞浸润之间的关系。结果表明，BCHEmRNA高表达与多种免疫细胞浸润相关，包括浆细胞、B细胞、调节性T细胞、NK细胞和巨噬细胞等（P 0.05，图2A）；进一步通过TIMER2.0数据库研究BCHE mRNA 表达与免疫细胞浸润之间的具体相关性。结果表明，在GC中BCHE mRNA 的表达与 B 细胞（r=0.192，P 0.001）、单核细胞（r=0.226，P 0.001）、巨噬细胞（r=0.169，P 0.001）、NK细胞（r=0.137，P=0.008）、肥大细胞（r=0.432，P 0.001）和癌症相关成纤维细胞（cancer fibroblast，CAF）（r=0.733，P 0.001）显著正相关；与 CD4+T 细胞（r=-0.256，P 0.001）和 CD8+T 细胞（r=-0.104，P=0.043）显著负相关（图2B）。2.3BCHE基因的富集分析为了解目的基因BCHE可能存在的生物学功能和信号通路，我们利用WGCNA算法和ESTIMATE算法筛选与BCHE基因相关的共表达基因，选择了与免疫细胞和基质细胞相关性最高的棕色模块（包含了188个与BCHE共表达的基因）（图3A），使用DAVID数据库对这188个基因进行富集分析，GO分第43卷第10期2023年10月何继凯，瞿文豪，贾佳琦，等.丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1356-13651359南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月表2BCHE mRNA及临床病理参数的单因素及多因素Cox回归分析Table 2Univariate analysis and multivariate Cox regression analysis of BCHE mRNA and clinical featuresBCHE mRNA的表达水平（低vs.高）年龄（低vs.高）性别（男vs.女）T分期（T1/2 vs.T3/4）N分期（N0/1 vs.N2/3）M分期（M0 vs.M1）TNM分期（+期 vs.+期）肿瘤类型（高/中分化vs.低分化）MSI（低vs.高）TMB（低vs.高）HR（95%CI）1.81（1.322.50）1.49（1.082.04）0.89（0.631.25）1.94（1.272.96）1.68（1.222.31）2.41（1.384.18）2.24（1.543.26）1.47（1.052.06）0.77（0.561.06）0.76（0.551.05）P值 0.0010.0100.5000.0020.0020.002 0.0010.0300.1000.090P值0.0060.0250.2600.2800.0190.3710.220HR（95%CI）1.75（1.172.62）1.54（1.062.26）1.39（0.792.46）1.31（0.812.12）2.28（1.144.54）1.30（0.732.29）1.29（0.861.95）单因素分析病理参数多因素分析记忆B细胞浆细胞B细胞CD8+T细胞CD4+T细胞静息的CD4+记忆T细胞活化的CD4+记忆T细胞辅助T细胞调节T细胞T细胞静息的NK细胞活化的NK细胞单核细胞巨噬细胞M0巨噬细胞M1巨噬细胞M2静息的树突状细胞活化的树突状细胞静息的肥大细胞活化的肥大细胞嗜酸性粒细胞中性粒细胞40200浸润比例（%）*BCHE mRNA高表达组（n=204）低表达组（n=203）r=0.733P0.001巨噬细胞癌症相关成纤维细胞NK细胞肥大细胞r=0.169P0.001r=0.137P=0.008r=0.432P0.0016420-0.200.20.4 00.025 0.050 0.075010203040 00.05 0.10 0.15浸润水平浸润水平浸润水平浸润水平GC0 0.250.5 0.75 1.00 00.1 0.2 0.3 0.4 0.5 00.050.1000.1 0.2 0.3 0.4 0.50200400600纯度浸润水平浸润水平浸润水平r=-0.124P=0.015GCCD4+T细胞CD8+T细胞B细胞单核细胞6420浸润水平BCHE mRNA表达水平（log2TPM）BCHE mRNA表达水平（log2TPM）r=-0.256P0.001r=-0.104P=0.043r=0.192P0.001r=0.226P0.001ABA：BCHE mRNA与免疫细胞浸润的相关性（CIBERSORT）；B：在TIMER2.0数据库中BCHE mRNA与免疫细胞浸润的相关性。图2BCHE与免疫细胞浸润的相关性分析Figure 2The correlation between BCHE and immune cell infiltration1360析结果表明BCHE的表达可能与细胞增殖、细胞黏附和细胞迁移等功能有关（图3B）。KEGG分析表明，BCHE的功能可能与PI3KAkt信号通路、TGF信号通路和癌症通路等有关（图3C）。ABCTaurine and hypotaurine metabolismComplement and coagulation cascadesMalariaHedgehog signaling pathwayTGFbeta signaling pathwayRelaxin signaling pathwayHippo signaling pathwayPhagosomeDiabetic cardiomyopathyAmoebiasisAGERAGE signaling pathwayin diabetic complicationsECMreceptor interactionProtein digestion and absorptionFocal adhesionProteoglycans in cancerHuman papillomavirus infectionPathways in cancerPI3KAkt signaling pathway1 2 3 4 5 6 7Count46810120.010.020.030.04PValueKEGG0.53（2e-31）-0.15（0.002）0.93（3e-183）0.83（5e-105）0.66（2e-53）0.84（1e-109）-0.21（1e-05）0.65（6e-51）-0.10（0.040）0.43（4e-20）0.48（1e-24）0.24（6e-07）0.39（8e-17）-0.32（5e-11）0.65（1e-50）-0.14（0.005）0.75（2e-76）0.72（1e-66）0.50（2e-27）0.68（4e-57）-0.29（2e-09）-0.65（9e-52）0.13（0.007）-0.73（2e-71）-0.71（3e-64）-0.50（2e-27）-0.68（1e-56）0.28（1e-08）1.00.50-0.5-1.0MEyellowMEgreenMEbrownMEredMEblueMEturquoiseMEgreyStromal ScoreImmune ScoreEstimate ScoreTumor Puritypositive regulation of cell division（BP）response to cAMP（BP）blood vessel development（BP）positive regulation of MAP kinase activity（BP）TGF beta receptor signaling pathway（BP）Wnt signaling pathway（BP）positive regulation of cell migration（BP）positive regulation of apoptotic process（BP）cellmatrix adhesion（BP）negative regulation of cell proliferation（BP）inflammatory response（BP）cell migration（BP）positive regulation of cell proliferation（BP）cell adhesion（BP）extracellular matrix（CC）transforming growth factor beta binding（MF）fibrinogen binding（MF）Count1020300.020.040.060.080 5 10 15 20 25PValueGOA：WGCNA热图，ESTIMATE算法分析BCHE mRNA与免疫细胞的相关性；B、C：采用GO（B）和KEGG（C）对BCHE进行富集分析。图3BCHE mRNA的富集分析Figure 3Enrichment analysis of BCHE mRNA2.4BCHE敲减对GC细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的影响为验证 BCHE 在 GC 细胞中的作用，本研究验证了该基因的体外功能。qRTPCR 检测发现，GC 细胞株（HGC27和MKN1）中BCHE mRNA 的表达显著高于胃组织正常细胞株（GSE1）（P 0.001，图 4A）。通过 siRNA 敲减 BCHE 表达，敲减效率如图 4B、C 所示，选择敲减效率最高的 1 号片段（siBCHE1）进行下游的功能实验。结果发现，BCHE 敲减后明显抑制了 GC 细胞的增殖能力（P 0.05）和克隆形成能力（P 0.001，图4DG）。黏附实验结果表明，BCHE敲减后能够促进GC细胞的黏附能力（P 0.05，图5A、B）。迁移和侵袭实验结果表明，BCHE敲减后明显抑制GC细胞的迁移（P 0.001）和侵袭能力（P 0.001，图5CF）。这些结果表明，BCHE是GC细胞中的一个促癌基因，敲减BCHE可抑制其介导的恶性生物学功能。3讨论BCHE是一个潜在的肿瘤标志物，其mRNA水平在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中显著升高9，19-20，且BCHE mRNA的高表达与子宫内膜癌和卵巢癌患者较差的总生存率相关19，21。本研究通过生信数据分析以及实验验证发现，BCHE在GC细胞中高表达，且BCHE mRNA的高表达与GC预后不良呈显著正相关。以上结果提示，BCHE可能是GC新的预后生物标志物。鉴于GC微环境对肿瘤发生发展和转移具有重第43卷第10期2023年10月何继凯，瞿文豪，贾佳琦，等.丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1356-13651361南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月ABCDED（450 nm）2.52.01.51.00.5024487296时间（h）*对照组siNC组siBCHE1组HGC27D（450 nm）2.01.51.00.5024487296时间（h）*对照组siNC组siBCHE1组MKN1siBCHE1BCHE mRNA相对表达水平（CAPDH标准化）*1.51.00.50siBCHE2siBCHE3siNCsiBCHE1BCHE mRNA相对表达水平（CAPDH标准化）*1.51.00.50siBCHE2siBCHE3siNCGES1BCHE mRNA相对表达水平（CAPDH标准化）*1086420MKN1HGC27对照组siNC组siBCHE1组HGC27MKN1对照组siNC组siBCHE1组对照组HGC27细胞克隆数*3002001000siNC组siBCHE1组*MKN1细胞克隆数*200150100500*对照组siNC组siBCHE1组FA：BCHE在GC和正常胃组织细胞系中的表达分析；B、C：qRTPCR检测HGC27（B）和MKN1（C）细胞系中BCHE的敲减效率；D、E：CCK8测定法检测BCHE敲减对GC细胞HGC27（D）和MKN1（E）增殖能力的影响；F、G：克隆形成实验分析GC细胞HGC27（F）和MKN（G）中敲减BCHE对细胞克隆形成能力的影响。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001（n=3）。图4敲减BCHE抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成的能力Figure 4Knockdown of BCHE inhibits proliferation and colony formation of gastric tumor cells要作用，本研究使用CIBERSORT算法和TIMER 2.0数据库分析发现，BCHE mRNA高表达与B细胞、癌症相关成纤维细胞及巨噬细胞的浸润呈正相关，与CD4+T和CD8+T细胞浸润呈负相关。研究报道显示，肿瘤微环境中存在较多的免疫细胞亚型，部分免疫细胞亚型与肿瘤患者较差的预后相关，如M2型巨噬细胞、调节性B细胞、癌症相关成纤维细胞等22-24；亦有研究表明，B细胞浸润可能和肿瘤转移相关25。另外，部分 T 细胞上高表达免疫抑制性分子（如PD1、CTLA4）等，当与携带相应配体的肿瘤细胞结合时，可抑制效应性T细胞的杀伤功能，从而使肿瘤细胞逃脱体内免疫系统的检查点监视，这G1362ABCDEF对照组siNC组siBCHE1组*细胞迁移率（%）5040302010002448MKN1时间（h）对照组siNC组siBCHE1组*细胞迁移率（%）604020001224时间（h）*HGC27对照组siNC组siBCHE1组黏附率（%）1101009080706050248时间（h）*MKN1对照组siNC组siBCHE1组*黏附率（%）1501005002468时间（h）HGC270 h12 h24 h对照组siNC组siBCHE1组HGC27对照组siNC组siBCHE1组0 h12 h24 hMKN1对照组siNC组siBCHE1组HGC27对照组siNC组siBCHE1组MKN1对照组*4003002001000siNC组siBCHE1组*HGC27细胞数*100806040200*MKN1细胞数对照组siNC组siBCHE1组A、B：细胞黏附实验分析敲减BCHE对GC细胞HGC27（A）和MKN1（B）黏附能力的影响；C、D：划痕实验分析敲减BCHE对GC细胞HGC27（C）和MKN1（D）迁移能力的影响；E、F：迁移和侵袭实验分析敲减BCHE对GC细胞HGC27（E）和MKN1（F）迁移和侵袭能力的影响。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001（n=3）。图5敲减BCHE抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力Figure 5Knockdown of BCHE inhibits invasion and migration of gastric tumor cells第43卷第10期2023年10月何继凯，瞿文豪，贾佳琦，等.丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1356-13651363南京医科大学学报第43卷第