2、细菌分离培养、接种技术及生化.ppt
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1、第三章 临床细菌学检验技术第二节 细菌分离培养与鉴定 P35 细菌在适宜的条件下方可生长繁殖,临床细菌标本只有经过细菌的分离培养鉴定和药敏试验,才能对感染性疾病作出病原学诊断和指导临床用药。故细菌的分离培养对疾病的预防与诊治有重要作用。2021/5/241一、培养基的种类和选择(一)基本条件1.合格的细菌实验室2.合格的无菌实验室3.基本设备和器具2021/5/242(二)培养基 培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的,专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。用途:可用于细菌的分离纯化、传代和菌种保存可用于研究细菌的生理生化特性是对病原菌分离鉴定的主要环节和必不可少的手段
2、2021/5/2431.培养基的组成成分:营养物质:水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子(Vit、aa、嘌呤、嘧啶等)。2021/5/244凝固物质:最常用的为琼脂(agar),它是从石花菜中提出来的一种半乳糖胶,100溶解,40凝固,可利用琼脂来改变培养基的物理性状(固体或半固体),它是理想的固体培养基的赋形剂,其本身不被细菌分解利用,也无营养作用。2021/5/245抑菌剂和指示剂:不是细菌生长繁殖的必需物质,是制备细菌的选择、鉴别培养基和判断结果的需要。常用的抑菌剂有:胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。常用的指示剂有:酚红、中性
3、红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂,美兰为常用的氧化还原指示剂。2021/5/2462.培养基的分类 液体培养基:牛肉汤(牛肉浸液+1%蛋白胨 +0.5%NaCl pH7.4)半固体培养基:加0.20.5%agar 固体培养基:营养物+2%agar 按按物物理理性性状状2021/5/247基础培养基:是其他培养基的基础,如普通肉汤、普通琼脂平板、斜面、高层营养培养基:BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面选择培养基:SS平板、BS平板、Mac平板等鉴别培养基:糖发酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培养基:厌氧培养基、高渗培养基等按用途2021/5/2483.常用培养基的制备肉膏
4、汤的制备:0.3%牛肉浸膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl加热溶解,调pH 7.47.6,分装,121,20分钟高压灭菌冷后待用。可用于标本和细菌的增菌。普通琼脂平板、斜面、高层:肉膏汤+2%agar,加热溶解,121,20分钟高压灭菌冷至50 平皿 普通琼脂平板:分离纯培养和药敏 倾倒 试管(斜放)普通琼脂斜面:增菌、保存细菌 试管(直立)普通琼脂高层:备用 2021/5/249血琼脂平板:普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50+5%10%脱纤维SRbc或RRbc,摇匀,倾倒无菌平皿,冷凝后即成血平板。常用于营养要求较高的细菌的分离纯培养和药敏。半固体肉汤:牛肉汤(牛肉浸膏汤)+0.2%0.5%ag
5、ar加热溶化 分装高压灭菌冷却即成。常用于保存菌种和观察细菌的动力。2021/5/24104.选择适当的培养基:根据临床标本中细菌的需要,选择适当的培养基。2021/5/2411二、分离培养 (一)细菌的分离1.平板划线分离法分离纯培养 分区划线 连续划线2.斜面接种法 连续蜿蜒划线,从斜面底部至斜面顶端3.液体接种法 在试管内壁与液面交接处管壁上研磨,使细菌混于液体中。4.半固体接种法 穿刺接种法2021/5/24125.倾注平板法 取一定量的稀释标本加入无菌平皿,再加入冷至45左右的定量培养基,混匀,待凝后倒置培养。6.涂布法 把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。7.定量接种环法 把
6、定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。2021/5/2413(二)细菌的培养方法 根据临床初步诊断及待检细菌的种类,可选用不同环境条件进行培养,常用培养方法有:1.需氧培养:适用于需氧菌和兼性厌氧菌,在有氧环境下35孵育1824h。2.CO2培养:适用5%10%CO2环境才生长良好的细菌,如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌的首次分离培养。供给CO2的方法有:CO2培养箱、烛缸法、化学法(每升容积0.4gNaHCO3+0.35ml浓HCl)。3.厌氧培养法:适用于厌氧菌的分离培养,常用的方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。2021/5/24142021/5/2415(三)细菌的生长情况在
7、平板上呈菌落(colony)生长,常用于细菌分离 纯培养在斜面上呈菌苔或菌落生长,可用于增菌或保 存菌种。半固体中呈迁徙生长(有动力)。可用于观察 动力和保种。在液体中呈表面生长,均匀混浊生长和沉淀生 长。可用于增菌和鉴别细菌。2021/5/2416思考题1.细菌有哪些分离培养与接种技术?2.简述细菌在不同培养基中的生长情况及实际意义?2021/5/2417三、生化反应 由于不同种类细菌的酶系统不同,故其新陈代谢过程中的合成代谢产物(毒素)与分解代谢产物(生化反应)也不一样,借此可鉴别细菌。生化反应:不同菌体内具有不同的独特酶系统,故对各底物(糖、蛋白等)的分解产物也不一样,用此方法来鉴别细菌
8、叫生化反应。2021/5/2418(一)碳水化合物的代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验 产酸(+):丙酮酸、乳酸、甲酸等原理:细菌 糖类 产酸产气:CO2、H2 不分解:(-)由于不同细菌菌体内的酶系统不同,可分解单糖(葡萄糖),双糖(乳糖),多糖(淀粉)和醇类(甘露醇),糖苷(水杨苷),代谢产物也不一样,可借此来鉴别细菌。酶酶2021/5/2419培养基:肉膏汤+1%待试糖+指示剂溶化调 pH7.4 分装高压灭菌冷后待用。有液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。方法:把分纯的细菌1%糖(醇、苷)类培养基,35 1824h 观察结果。产酸产气:如大肠埃希菌GS 结果 +产酸不产气:如伤寒b、
9、痢疾b GS +-培养基不变色:如卡他莫拉菌应用:是鉴别细菌最主要和最基本的试验,特别是肠杆菌科鉴定的主要试验。2021/5/24202.氧化-发酵试验(O/F试验)原理:分解GS 氧化型细菌,如微球菌、绿脓b 细菌 分解GS 发酵型细菌,如葡萄c、肠杆菌科 不分解GS 产碱型细菌,如莫拉莫拉菌培养基:HL培养基(蛋白胨2g、NaCl 5g、GS 10g、agar 2.5g、K2HPO412H2O 0.3g、0.2%溴麝香草酚兰12ml、加蒸馏水至1000ml,调pH 7.2)碱性时为绿色,酸性时为黄色。方法:将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm),3
10、5培养48h。有O2有O2或无O22021/5/2421结果:应用:检测细菌的代谢类型,进而鉴别细菌。如肠杆菌科细菌为发酵型,而非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌(发酵型)和微球菌(氧化型)的区别。注意事项:对营养要求高的细菌应在HL培养基中加入2%血清或0.1%的酵母浸膏。阴性者要延长培养时间34天再观察结果。指示剂不能用酒精溶解。液体石蜡2021/5/24223.-半乳糖苷酶(ONPG)试验原理:ONPG 邻-硝基酚 +-D-半乳糖试剂:0.75M ONPG溶液,为无色,若出现黄色,则 不应再用。方法:从KIA斜面上刮取菌苔,加入0.25ml无菌NS制成菌悬液,加入1滴甲苯充分振摇
11、,使-半乳糖苷酶释放,置37水浴5分钟,加入0.25ml ONPG试剂,水浴(3537)20min3h,观察结果。结果:菌悬液呈现黄色为阳性。-半乳糖苷酶半乳糖苷酶水 解2021/5/2423应用:本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。迟缓分解乳糖的细菌(宋内志贺菌等)只有-半乳糖苷酶(胞内酶),缺乏半乳糖苷渗透酶(胞外酶)或活性很低,故需几天才能将乳糖分解,若采用ONPG试验则可迅速(2030min)得出结果。因为ONPG与乳糖十分相似,且分子较小,它不需半乳糖苷渗透酶则可进入细胞内,而被细胞内的-半乳糖苷酶分解为半乳糖和黄色的邻-硝基酚。ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致,这主要取
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